鲟鱼循环水养殖系统中生物滤池的水质变化及微生物群落结构响应❋
时间：2023-02-23 10:15:07 来源：千叶帆 本文已影响人
陈 奇,宋协法❋❋,周广军，薛致勇
(1.中国海洋大学水产学院，山东 青岛 266003；
2.烟台市海洋经济研究院，山东 烟台 264034；
3.海阳市黄海水产有限公司，山东 烟台 265122)
循环水养殖系统稳定运行期间生物滤池中硝化细菌的数量是动态变化的，但影响其时空分布的主要环境因子目前尚未明确。本研究以杂交鲟(施氏鲟Acipenserschrenckii♀×西伯利亚鲟Acipenserbaerii♂)循环水养殖系统的四级生物滤池为研究对象，运用16S rRNA高通量测序手段研究微生物的群落结构、种群稳定性以及功能菌在生物滤池中所起的作用。探究循环水养殖系统的生物滤池中微生物群落结构、微生物群落对水质变化的响应及生物滤池的运行参数，为鲟鱼及其他名贵鱼类的循环水养殖系统生物滤池的设计与运行提供技术支撑和理论数据。
1.1 养殖系统
实验系统位于山东省海阳市黄海水产有限公司7号养殖车间，整个系统由9个养殖池(养殖面积50 m2，有效水深1 m)、转鼓式微滤机、生物滤池、充氧池和紫外线杀菌消毒装置等组成。养殖用水盐度13，日补充水量约占总水量的15%，循环率为8次/d。生物滤池分为四级(1～4级生物滤池)，其中2级为MBBR，生物滤料为比表面积600 m2/m3的多孔塑料环，其余3级为固定床，生物滤料为比表面积316 m2/m3的立体弹性填料，均采用自然挂膜。
2019年6月开始鲟鱼养殖，初始养殖密度为42.5 kg/m3，鲟鱼平均体长为(74.58±4.24)cm、平均体质量为(3.87±0.56)kg，鱼体健康状况良好。养殖过程中投喂鲟鱼专用颗粒饲料(升索牌G8饵料，粗蛋白含量44%)，每天投饵2次，时间为7:30和16:30，日投喂量为鱼体质量的0.36%。
1.2 水质检测方法
实验期间，每5天测定1次各级生物滤池进、出水水质。水温、溶解氧、pH采用YSI多参数水质分析仪于现场检测；
总氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮、化学需氧量等指标在实验室根据《海洋监测规范第4部分：海水分析》(GB17378.4—2007)操作规范进行检测，每个指标测定3次,结果取平均值。
1.3 样品采集和高通量测序
将四级生物滤池按水流方向依次标为A～D，并在实验第1、11、21、31、41天分别从4个滤池中以五点取样法剪取滤料样品，混合样品约15 g分别放入编号A～D的50 mL取样管中[8]，加40 mL无菌水后放入-80 ℃冰箱中保存，并将样品送至上海美吉生物医药科技有限公司在Illumina-MiSeq平台上进行测序分析。
1.4 分析方法
使用Microsoft Excel和SPSS 26.0软件对各级生物滤池的水质数据进行统计分析和单因素方差分析。根据Index序列区分各样本的数据，将其以fasta格式保存，利用Qiime(version 1.9.1)对数据进行检测并去除嵌合体序列[9]。利用Uparse软件(version 7.0.1090)按照97%相似性进行OTUs聚类(不含单序列)，形成OTUs列表[10]。用RDP Classifier(version 2.11)对OTUs代表序列进行比对分析，在不同分类学水平上注释其群落的物种信息[11]。基于OTU聚类的结果，利用R语言工具计算Shannon和Chao1指数[12]，对微生物群落与测定的各环境理化指标进行主成份分析(PCA)和冗余分析(RDA)[13]。
2.1 四级生物滤池水处理性能及分析
实验期间，循环水养殖系统运行稳定，四级生物滤池进、出水的水质参数如表1所示，生物滤池进、出水的总氨氮浓度、COD浓度存在显著性差异(P<0.05)，水温18.2 ℃、溶解氧6.24 mg/L、pH 7.0。总氨氮、亚硝态氮和化学需氧量的去除率为60.23%、15.56%和33.77%。生物滤池总进水与1、2、3级生物滤池出水的总氨氮浓度依次显著降低(P<0.05)，说明前3级生物滤池对氨氮去除效果明显；
相反，3级生物滤池出水和生物滤池总出水总氨氮浓度相差不大，即4级生物滤池的氨氮去除率较差；
而2级生物滤池出水COD浓度显著低于1级生物滤池出水COD浓度(P<0.05)，说明COD的去除主要发生在2级生物滤池。
2.1.1 总氨氮(TAN)去除率变化 生物滤池总进水的TAN浓度为 0.209～0.369 mg/L，总出水的TAN浓度为0.047～0.164 mg/L，TAN总去除率平均为60.23%(见图1)，生物滤池可有效去除养殖水中的氨氮，且水质稳定在一定范围内。其中，1级生物滤池的TAN去除率为21.65%，占总去除率的36.81%；
2级生物滤池的TAN去除率为24.74%，占总去除率的31.21%；
3级生物滤池的TAN去除率为26.80%;占总去除率的26.00%；
4级生物滤池的TAN去除率为9.5%，占总去除率的5.98%。1、2、3级生物滤池对TAN的去除率显著高于4级生物滤池(P<0.05，见表2)，4级生物滤池对TAN去除效果不明显。
表1 各级生物滤池进、出水的水质参数Table 1 Water quality parameters of inlet and outlet water at all levels of biological filter
表2 各级生物滤池去除率Table 2 Removal rate of various biological filters %
2.1.4 COD去除率变化 生物滤池总进、出水的COD浓度存在显著性差异(P<0.05，见表1)，总进水的COD浓度为2.43～4.43 mg/L，出水的COD为1.39～2.88 mg/L，去除率为33.77%。试验期间COD去除率变化如图4所示。其中，1级生物滤池的COD去除率为-1.21%，2级生物滤池的COD去除率为25.18%，3级生物滤池的COD去除率为-11.49%，4级生物滤池的COD去除率为18.59%。2、4级生物滤池的COD去除率显著高于1、3级生物滤池(P<0.05，见表2)，2、4级生物滤池的COD去除效果更明显。
2.2 生物滤池微生物群落多样性变化
2.2.1微生物群落多样性指数变化 20个生物膜样品均得到原始序列数和多样性指数(见表3)，样本覆盖率(Coverage)为100%。通过比较5个时间点生物滤池的多样性指数发现，第3个时间点整个生物滤池平均Shannon指数为5.650，高于其他4个时期。微生物群落丰富度和多样性在第3、4、5个时间点时依次降低。
表3 微生物群落多样性指数Table 3 Microbial community diversity index
续表3
2.2.2 微生物群落组成变化 20个生物膜样品中微生物群落结构组成相似(见图5)，微生物主要隶属于37个门，561个属，926个种，其优势菌为变形菌门(Proteobacteria,19.4%～38.1%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,10.6%～27.3%)、绿弯菌门(Chloroflex，10.7%～21.1%)、浮霉菌门(Planctomycetes，3.9%～30.9%)、疣微菌门(Verrucomicrobiota，1.0%～12.1%)，其组成分布在门水平上与先前报道的结果相似[14-16]。
优势菌属(见图6)分别为：norank_f__AKYG1722(4.11%～9.31%)、unclassified_f__Rhodobacteraceae(3.21%～8.85%)、norank_f__Saprospiraceae(3.25%～9.63%)、norank_f__Caldilineaceae(0.97%～7.90%)、unclassified_f__Flavobacteriaceae(1.10%～6.81%)、unclassified_k__norank_d__Bacteria(0.87%～4.66%)、浮霉菌属(Planctomicrobium，0.048%～16.50%)。它们分别属于AKYG1722科、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、暖绳菌科(Caldilineaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)等。在生物滤池中起硝化作用的主要细菌是氨氧化细菌和亚硝化细菌[17]，此生物滤池中的相关细菌有硝化螺旋菌属(Nitrospira,0.037%～1.43%)和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas，0.054%～0.21%)细菌。其中，硝化螺旋菌属在时间上相对丰度显著性降低(见图7)，虽然这些菌属的丰度不高，但其是水处理过程中起十分重要作用的功能性细菌[18]。
2.2.3 不同时期微生物群落的相似性分析 OTU(Operational taxonomic unit)水平PCA分析(见图8)所示，两轴的总贡献率为67.99%。其中，主坐标1的方差贡献率为47.40%，主坐标2的方差贡献率为20.59%。在空间上，1、3、4级生物滤池各样本点之间的相似度较高，与2级生物滤池样本点之间相似度较低，说明1、3、4级生物滤池中微生物群落有更高的相似性；
在时间上，2级生物滤池3个时间点(B1、B2、B3)的相似度较高，与B4、B5之间相似度较低。结果表明，不同样品的微生物群落差异较大，即各级生物滤池中不同时期的微生物群落差异较大。
2.3 微生物群落组成与水环境因子的响应分析
(1)本实验发现生物滤池对总氨氮、亚硝酸盐和化学需氧量的去除率分别达到60.23%、15.56%和33.77%，整个过程对亚硝酸氮去除不明显。其中，4级生物滤池进、出水的总氨氮、亚硝酸盐和COD浓度相差不大，相较于前3级生物滤池对氨氮的去除效果不明显，其可能存在功能上的浪费。
(2)通过高通量测序，本次实验生物滤池中微生物隶属于37个门，100个纲，240个目，369个科和561个属的细菌，其主要为变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门。1、3、4级生物滤池的微生物群落组成相似，且在时间、空间尺度上存在动态变化。
(3)受生物滤池的水环境因子的影响微生物群落结构并非一成不变，即其对水质变化有一定程度的动态响应。在实际生产中可以合理调节生物滤池内COD浓度来稳定生物滤池运行期的微生物群落结构，增加硝化螺旋菌属、亚硝化单胞菌属细菌的丰度，从而提高生物滤池的水处理效率。
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