色谱及质谱检测技术在粮食质量安全监测中的应用研究
时间：2023-02-25 17:45:08 来源：千叶帆 本文已影响人
董 娜，罗蓰超，杨忠宝
（吉林省粮油卫生检验监测站，长春 130033）
“民以食为天，食以安为先”，加强粮食质量安全监测是确保国家粮食质量安全的基石。粮食质量安全监测的检测项目主要包括真菌毒素、农药残留和重金属等。
色谱仪是一种很好的分离用仪器，但其检测能力差；
质谱仪是一种很好的检测仪器，其定性定量能力突出，但对混合物的分离无能为力。色谱与质谱联用可以相互取长补短，成为集分离、定性、定量于一体的分析技术。色谱与质谱联用后，首先样品被色谱分离，然后进入质谱被进一步离子化，离子碎片经质谱的质量分析器后,按荷质比分开，经检测器得到质谱图，通过与数据库对比可以得到所分析物质的名称以及含量。在粮食质量安全监测中，色谱及质谱检测技术在检测真菌毒素和农药残留时应用最多。
1.1 真菌毒素的种类和危害
真菌毒素是某些真菌在粮食中生长繁殖所产生的次级代谢产物，在粮食收获前后可大范围地污染粮食。据联合国粮食与农业组织(FAO)统计，世界粮食超过25%被真菌毒素所，每年仅美国粮食产业因真菌毒素污染产生的损失就高达9.23亿美元。目前已被确认化学结构的真菌毒素达400多种，在粮食中存在较多且影响较大的真菌毒素主要有：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、单端孢霉烯族化合物以及玉米赤霉烯酮等。
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类真菌毒素，主要有B1、B2、G1、G2等羟基化代谢产物，其中黄曲霉毒素B1的毒性和致癌性最强，易诱发肝癌，且在粮食中污染最广泛，因此，在粮食质量安全监测中，主要以黄曲霉毒素B1为检测指标；
赭曲霉毒素由赭曲霉、鲜绿青霉等代谢产生，包括A、B、C、D等多种结构类似的化合物，其中赭曲霉毒素A毒性最强，易诱发肾病、肠炎，严重可导致肾脏癌变；
伏马毒素是一类主要由层出镰刀菌和串珠镰刀菌等霉菌代谢产生的真菌毒素，由于其化学结构的不同，可分为A、B、C和P四类，其中B类毒性最强，伏马毒素被认为是诱发人体食道癌的病因，对各种动物的影响不一，研究发现低剂量的伏马毒素就能引起马匹的脑白质软化症，在猪体内会攻击心肺系统；
单端孢霉烯族化合物是由镰孢菌、头孢菌和木霉菌等代谢产生的一组具有相似生物活性和化学结构的有毒代谢产物，按照功能团将其分为A、B、C、D四个类型，其中A和B最为常见，A型常见的有T-2毒素、HT-2毒素等，B型有脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇等，单端孢霉烯族化合物的毒性作用主要有细胞毒性、免疫抑制和致畸致癌作用，而A型毒性又比B型大；
玉米赤霉烯酮是由禾谷镰孢等镰刀菌属的菌种代谢所产生的次级产物，并无剧毒，但会对哺乳动物的生殖系统产生伤害。常见的真菌毒素如表1所示。
表1 常见真菌毒素名称及英文简写
1.2 真菌毒素的仪器分析方法
真菌毒素的仪器分析方法除了色谱与质谱联用技术外，还有荧光光度法和毛细管电泳法等，但色谱与质谱联用技术以集分离、定性、定量于一体，高选择性、灵敏高效等优点，成为近年来检测粮食中真菌毒素的常用手段。色谱与质谱联用技术又包括气相色谱质谱联用技术（GC-MS）和液相色谱质谱联用技术（LC-MS），由于大多数真菌毒素遇热不稳定，而GC及GC-MS又仅用于分析易挥发、热稳定性好的化合物，因此，采用GC-MS分析的真菌毒素种类有限，多为单端孢霉烯族化合物，但是，由于该化合物不易挥发，因此样品净化后需进行衍生化处理，使操作更加繁琐。林缨等[1]采用固相萃取-气相色谱-串联质谱法检测粮食作物中的T-2毒素和HT-2毒素，研究结果表明，两种毒素最低检出限均在0.05～0.5 μg/kg，回收率均在47.2%～110.8%。焦玉英[2]用气相色谱和质谱联用检测粮食中的镰刀菌毒素，DON和NIV的检出限为1 μg/kg。LC和LC-MS是真菌毒素检测最常用的分析仪器之一，尤其LC-MS联用技术，可同时提供目标化合物的保留时间和分子结构信息，灵敏度高，既适用于多组分检测，又降低了前处理的净化要求。
1.3 真菌毒素的前处理方法
虽然LC-MS联用技术能降低前处理的净化要求，但粮食种类繁多、基质复杂，且粮食中真菌毒素含量低（一般为μg/kg级），采用哪种前处理方法，既能去除杂质，达到降低干扰的目的，又能最大限度保留待测组分，直接关系到检测结果的准确性，因此，采用正确有效的前处理方法能使粮食中真菌毒素的检测事半功倍。常用的前处理方法主要有液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）等。
液液萃取（LLE）是利用待测组分在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使待测组分从一种溶剂转移到另一种溶剂，经过多次反复萃取，从而达到提取待测组分的目的，乙腈/水体系是LLE应用最多的提取溶剂。液液萃取（LLE）作为最常规的提取方法，应用虽广，但其净化能力有限，为了达到更好的净化效果，常与其他净化技术相结合应用。随着质谱技术的快速发展，经过LLE提取稀释后直接测定的研究也越来越常见。叶金等[3]采用乙腈-水-乙酸（70∶29∶1，V∶V∶V）溶液直接提取后，结合稳定同位素稀释技术，利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱进行检测，建立了粮食中NIV、DON等16种真菌毒素的快速测定方法，结果表明，16种真菌毒素在一定浓度范围内均具有良好线性关系，在大米、小麦、玉米、大麦4种粮食中的加标回收率为75.3%～123.5%。
固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂（固相）吸附样品中的待测化合物，将其与基体和干扰化合物分离，然后用适当的溶剂洗脱，从而达到分离和富集的目的。固相萃取柱种类繁多，常见的有氨基固相萃取柱、C18固相萃取柱、石墨化炭黑固相萃取柱、阴离子交换树脂固相萃取柱、HLB固相萃取柱以及多功能净化柱（MFC）、免疫亲和柱等。孙月等[4]建立了采用乙腈-水（80∶20，V∶V）提取，氨基固相萃取柱净化，LC-MS/MS检测粮食中OTA的方法。孟娟等[5]建立了采用乙腈-水（84∶16，V∶V）提取，石墨化炭黑固相萃取柱净化，LC-MS/MS检测粮食及其制品中6种玉米赤霉烯酮类物质的方法。钟世欢等[6]建立了将样品经乙腈-水（80∶20，V∶V）超声提取，HLB固相萃取柱净化，经LC-MS/MS同时检测粮食中AFT、FB、DON等多种真菌毒素的分析方法。
多功能净化柱（MFC）为一种特殊的SPE柱，以极性、非极性及离子交换等基团组成填充剂，可选择性吸附样液中的脂类、蛋白质类、色素类等杂质，而真菌毒素不被吸附可直接通过，不需要进行活化、淋洗和洗脱操作，直接上样即可，操作更加简便快捷，而且可同时净化多种毒素，回收率高，而且多功能净化柱稳定性较高，降低了检测成本，提高了检测效率，广泛应用于粮食中真菌毒素检测当中。刘红河等[7]建立了采用乙腈-水（84∶16，V∶V）超声提取，MFC净化，LC-MS/MS检测粮食中DON、ZEN等12种真菌毒素的方法。高蓓等[8]建立了采用乙腈-水（84∶16，V∶V）提取，MFC净化，同位素内标法定量，LC-MS/MS检测粮食中DON、NIV等5种真菌毒素的方法。郑翠梅等[9]建立了乙腈-水-乙酸（84∶15∶1，V∶V∶V）提取,多功能净化柱和强阴离子交换柱净化，LC-TOF MS同时检测粮食中13种真菌毒素的方法。
免疫亲和柱（IAC）是利用免疫亲和层析原理，利用生物大分子具有对某一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而制成，用以分析检测抗体和抗原的亲和层析柱。其极强的特异识别能力，使其能与待测真菌毒素产生较强作用，抗干扰能力强，尤其适合粮食中低浓度真菌毒素的检测，检出限低。多功能净化柱（MFC）和免疫亲和柱（IAC）都已被商品化，但IAC的种类比MFC少得多，原因是真菌毒素的相对分子质量较小（基本小于1 000），大部分真菌毒素都属于弱免疫物质。常见的商品化IAC主要有AF、ZEN、DON、OTA、FB、T-2、HT-2、CTN等 种 类。徐飞等[10]建立了经乙腈-水（20∶80，V∶V）提取，IAC净化，LC-MS/MS检测粮食中黄曲霉毒素的快速分析方法。曾羲等[11]建立了采用乙腈-水（84∶16，V∶V）提取，IAC净化，同位素内标法定量，LC-MS/MS检测粮食中赭曲霉毒素A、B、C的方法。
除了上述前处理方法，一些新型的前处理技术也层出不穷，例如大孔树脂吸附、凝胶渗透色谱、快速简便高效安全萃取（QuEChERS）等[12]，苏碧玲等[13]建立了采用乙腈-水（84∶16，V∶V）超声提取，QuECh-ERS净化，LC-MS/MS检测粮食制品中DON等4种真菌毒素的方法。我国现行有效的国家标准，将液相色谱-串联质谱法纳入真菌毒素的测定方法，表2列出了国家标准规定的液相色谱-串联质谱法测定粮食中几种常见真菌毒素的前处理方法。
2.1 农药残留的种类和危害
粮食中农药残留的产生，除了农药通过农作物吸收而污染粮食外，另一途径是贮藏期间直接施用于粮食的各种杀虫剂、抑菌剂和杀鼠剂等化学药剂。按照功能的不同，可分为杀虫剂（杀虫脒、敌百虫等）、杀菌剂（多菌灵、稻瘟净等）、杀螨剂（三氯杀螨醇、溴螨酯等）、除草剂（甲草胺、除草醚等）等；
按照其分子结构的不同，可分为有机氯农药、有机磷农药、氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药等。
有机氯农药是分子结构中含有氯的有机杀虫剂、杀菌剂的总称。常见的有滴滴涕、六六六、狄氏剂、艾氏剂、氯丹、六氯苯、毒杀芬等，由于滴滴涕和六六六具有广谱、高效、价廉、中等毒性等优点，两者一度成为我国使用最多的农药，占到农药总量的60%～70%，但其化学性质稳定，在自然界中难以被分解，日积月累，使得土壤、农产品均受该农药污染。2000年12月，全球会议将滴滴涕等多种有机氯农药列为有必要禁止生产和使用的12种持久性污染物。有机氯农药具有较强的蓄积性，长期食用含有有机氯农药残留的粮食，会引起慢性中毒，据报道，滴滴涕、六六六等有机氯农药具有致癌性。
有机磷农药是分子结构中含有磷的有机杀虫剂、杀菌剂的总称，是目前使用最广泛的农药。常见的有敌敌畏、敌百虫、马拉硫磷、甲拌磷、二嗪磷、乙嘧硫磷、巴胺磷、甲基嘧啶硫磷、稻瘟净、乐果、喹硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、磷铵、内吸磷等。有机磷农药不仅种类繁多，其毒性差异也较大，可分为剧毒、中等毒性、低毒三类，常见的剧毒有机磷农药有对硫磷、甲拌磷、磷铵、内吸磷等，中等毒性的有敌敌畏、甲基对硫磷、甲基内吸磷等，低毒的有敌百虫、乐果、马拉硫磷、杀螟硫磷等。有机磷农药经皮肤、呼吸道和肠胃等途径进入人体，主要表现为抑制胆碱酯酶的活力，使其丧失分解乙酰胆碱的能力，从而引起一系列的中毒反应，如头晕恶心、多汗乏力、瞳孔缩小、腹泻腹痛、支气管分泌物增多等，严重的可导致中枢神经系统功能失常，长期摄入会出现肝功能下降、血糖升高、免疫力下降等一系列病变，甚至会致畸、致癌、致突变。
氨基甲酸酯类农药是一种氨基甲酸的N-甲基取代酯类的合成农药。具有广谱、高效、选择性强、残留期短等特点，常见的有速灭威、西维因、涕灭威、克百威、叶蝉散、抗蚜威等，氨基甲酸酯类农药虽不是剧毒化合物，但具有致癌性。
拟除虫菊酯类农药是一类具有高效、广谱、低毒和能生物降解等特性的合成杀虫剂，其杀虫能力比有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类农药高10～100倍。常见的有溴氰菊酯、氯氰菊酯等。拟除虫菊酯类农药对人体低毒，其危害主要为通过影响神经轴突的传导而导致肌肉痉挛等。
2.2 农药残留的仪器分析方法
色谱法是最常见的农药残留检测的仪器分析方法之一，主要有薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法，其中气相色谱法在检测粮食中农药残留时应用最为广泛，大多数农药的分子量小于400，且其沸点在气相色谱工作温度范围内，所以大多数农药残留可用气相色谱测定，为使检测结果准确度和精密度更高，不同种类的农药选择不同类型的检测器，例如检测有机磷农药可选用火焰光度检测器（FPD），检测有机氯和拟除虫菊酯农药可选用电子捕获检测器（ECD），检测氨基甲酸酯类农药可选用火焰热离子检测器（FTD）。选用质谱仪作为检测器时，即成为气相色谱-质谱联用仪，两者联用属于强强联合，MS在定性分析上有绝对优势，而且在痕量定量和GC分不开（保留时间相同）的情况下定量也有优势。
GC-MS和HPLC-MS联用技术已被广泛应用于粮食中农药残留检测中。例如GB/T 5009.219—2008[19]、GB/T 5009.220—2008[20]、GB/T 5009.221—2008[21]分别规定了GC-MS联用法测定粮谷中矮壮素、敌菌灵、敌草快的残留量；
SN/T 3768—2014[22]规定了GC-MS法测定出口粮谷中多种有机磷农药残留量；
SN/T 2085—2008[23]规定了HPLC-MS/MS法测定进出口粮谷中多种氨基酸甲酯类农药残留量。
2.3 农药残留的前处理方法
在用色谱法检测农药残留之前，样品要经过提取、净化，提取和净化属于前处理部分。样品前处理不仅要尽可能提取其中的待测组分，还要尽可能除去与待测组分同时存在的杂质，避免造成色谱柱和检测器等的污染，降低对检测结果的干扰，提高检测的灵敏度和准确性，因此，样品前处理的好坏直接影响农药残留测定结果的准确性和可靠性。
常见的农药残留分析步骤通常为：水溶性溶剂提取→非水溶性溶剂再分配→固相吸附柱净化→气相或液相色谱检测。随着检测技术的发展，GC-MS和HPLC-MS联用技术已被广泛应用于粮食中农药残留的检测当中。液液萃取法（LLE）和固相萃取法（SPE）是农药残留分析中常用的前处理方法，为了取得更好的前处理效果，LLE和SPE通常共同配合使用，但为了简化操作、提高回收率，有研究者采用LLE后直接进样分析，高玲等[24]采用液-液萃取技术对大米中36种有机磷类农药进行提取，无需净化，直接进样分析，结果表明，不同农药的检出限在0.001～3.5 μg/kg之间，方法定量下限在0.004～10μg/kg之间，精密度RSD＜15%（乐果除外），回收率在88.3%～108.3%之间，该法简便、快速、灵敏、可靠。
农药残留常用的提取溶剂为乙腈、丙酮等。固相吸附柱的种类繁多，根据吸附柱与目标物作用力的不同，可分为正向SPE小柱（如Florisil柱）、反向SPE小柱（如C18柱）、离子交换SPE小柱（如NH2柱）、混合型SPE小柱（如Carb-NH2柱）。王贵双等[25]以石油醚为提取剂，经Florisil固相萃取柱净化，GC-MS检测粮谷中17种有机氯和拟除虫菊酯农药残留，17种农残回收率为70.9%～110.3%，相对标准偏差为2.5%～10.3%，检出限为1.8～16.8 μg/kg；
张帆等[26]建立了乙腈提取、C18固相萃取柱净化、HPLCMS/MS测定大米中20种氨基甲酸酯类农药残留的方法；
张丹[27]用乙腈（加入无水硫酸钠、氯化钠）超声提取样品、经Carb/NH2和Florisil固相萃取柱净化、再经GC-MS测定2种鼠药和5种农药残留，结果表明该法快速、灵敏、准确，可用于实际检测分析；
聂留俊等[28]建立了乙腈超声提取、固相萃取柱净化、HPLC-MS测定大米中5种有机磷农药残留的方法，结果表明：不论采用NH2柱还是采用Carb/NH2固相萃取柱净化对分析结果影响不大，但Carb/NH2固相萃取柱具有去除色素等干扰物、保护色谱柱的优势。
此外，常用的前处理技术还有凝胶渗透色谱、基质固相分散萃取、QuEChERS技术、加速溶剂萃取等。凝胶渗透色谱（GPC）又称体积排除色谱或尺寸排除色谱，其核心部件是在一根不锈钢空心细管中加入孔径不同的微粒作为填料的色谱柱，由于待测样品中各组分分子量不同，在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开。每根色谱柱都有一定的相对分子质量分离范围和渗透极限。该方法具有应用范围广、净化快速高效等优点。李爱军等[29]采用乙酸乙酯提取、凝胶色谱和固相萃取柱（ENVI-Carb柱和Florisil柱）净化、GC-MS/MS测定粮谷中16种有机磷农药残留量，结果表明，添加水平在0.002～0.50 mg/kg时，回收率范围为78.4%～97.8%，相对标准偏差为9.7%～18.9%，测定低限为0.002 mg/kg。
基质固相分散萃取（MSPD）是将待测样品与涂有C18等多种聚合物的担体固相萃取材料一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。其优点是集提取、净化于一体，省去样品转移等操作，避免了样品损失，适于自动化分析。吴丽华等[30]研究了C18基质固相分散萃取（MSPD），HPLC-柱后衍生-荧光检测器测定小麦中6种氨基甲酸酯农药的方法，结果表明，6种农药的回收率为82.1%～94.0%，变异系数≤3.54%，方法的最低检出限为0.0092～0.038 mg/kg。
QuEChERS方法的操作步骤大致为：样品粉碎→单一溶剂乙腈提取分离→加入MgSO4等盐类除水→加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等吸附剂除杂→上清液进行GC-MS、LC-MS检测。该方法具有快速（quick）、简单（easy）、廉价（cheap）、高效（effective）、可靠（rugged）、安全（safe）等特点，利用此技术检测农残时能得到较高回收率。曾敏等[31]运用改良QuEChERS技术、GC-MS/MS测定粮谷中20种有机磷农药，结果表明，平均回收率在70.5%～105.2%之间，此方法的相对标准偏差RSD值为2.4%～15.9%。
加速溶剂萃取（ASE）是在提高的温度（50～200℃）和压力（10.3～20.6 MPa）下用溶剂萃取固体或半固体样品的自动化方法。该方法具有快速、溶剂用量少、回收率高和重现性好等优点。闵光等[32]采用加速溶剂萃取、活性炭固相萃取柱净化、GC-MS检测谷物中农药残留，结果表明，大米中农药回收率为78.9%～105.3%，RSD≤12.8%，检出限(LOD)为0.3～3.6 μg/kg；
玉米中农药回收率为80.9%～106.2%，RSD≤13.6%，检出限(LOD)为0.3～4.0 μg/kg。
色谱及质谱检测技术在粮食质量安全监测中应用越来越广泛，尤其是在真菌毒素和农药残留的检测中。粮食中真菌毒素和农药残留种类繁多且对人体产生不同程度伤害，因此，准确、快速地检测出其含量十分必要。色谱及质谱联用技术可以集分离、定性、定量于一体，具有高选择性、灵敏、高效等优点，在运用该技术检测粮食中真菌毒素和农药残留时，选择恰当的前处理手段，可取得事半功倍的效果。
重金属（铅、汞、砷、镉）也是粮食质量安全监测的检验项目之一。色谱及质谱联用技术也应用在重金属的检测中，例如GB 5009.11—2014[33]中规定液相色谱-电感耦合等离子质谱法（LC-ICP/MS）测定食品中无机砷含量，但色谱及质谱联用技术在真菌毒素和农药残留的检测中应用更为广泛。随着电子技术和计算机技术的快速发展，色谱和质谱联用技术也日臻完善，硬件性能大幅提高，向多功能、高通量、高灵敏度、小型化方向发展；
强大的数据分析软件功能也大大增强了仪器的自动化水平以及操作的灵活性。
