液相色谱-串联质谱法测定人血浆中美罗培南的浓度及其在ICU脓毒症患者治疗药物监测中的应用
时间：2023-02-26 23:20:02 来源：千叶帆 本文已影响人
张伟东，张伟威，阎 彦，周静芳，程业童，王 娜
(河北省秦皇岛市第一医院药学部，河北 秦皇岛 066000)
脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，严重威胁患者生命的安全，易导致重症加强护理病房(intensive care unit,ICU)患者死亡。因此，有效控制感染是降低ICU脓毒症患者病死率的关键。美罗培南具有抗菌谱广、杀菌作用强、对绝大多数β-内酰胺酶高度稳定等特点，是治疗重症感染的一线药物。早期的美罗培南经验性治疗对改善脓毒症患者的临床症状、降低病死率具有重要意义。随着美罗培南在临床上的广泛应用，导致耐药菌株不断增多[1-2]。2014—2019年，全国细菌耐药监测网监测结果显示：鲍不动杆菌和肺炎克雷伯菌对美罗培南的耐药率逐年上升[3-4]。ICU脓毒症患者多存在基础疾病，易出现多重细菌感染，导致其生理、病理状态迅速改变，使得美罗培南在其体内的表观分布容积、药物清除率等药代动力学参数与健康受试者存在较大差异。因此，开展美罗培南治疗药物临床监测对促进合理用药、减少耐药菌的产生具有重大意义。目前，人血浆中美罗培南浓度的检测方法有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[5-9]、液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[10-11]和超高效液相色谱-串联质谱法(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)等[12]。但HPLC法分析时间较长，刘炎等[8]采用HPLC法结合截尾技术测定美罗培南血药浓度，样品分析时间为7 min；
陈玲等[9]采用HPLC法检测人血浆中美罗培南浓度，样品分析时间约为5.6 min；
刘洪川等[11]采用双内标LC-MS/MS法测定人血浆中美罗培南浓度，样品分析时间为4 min；
王晓雪等[12]采用UPLC-MS/MS法进行美罗培南和亚胺培南治疗药物监测，单次样品分析时间大于4 min。本文将建立一种快速、准确、简便的LC-MS/MS法，并将该方法用于ICU脓毒症患者美罗培南治疗药物的临床监测，为科学合理的个体化给药方案的制定提供技术支持。
1.1药品 美罗培南(批号：130506-201403；
纯度：87%)，内标：卡马西平(批号：100142-201706；
纯度：100%)，均购自于中国食品药品检定研究院。健康人空白血浆购自于秦皇岛市第一医院血液中心。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，购自于德国默克公司；
水为超纯水(18 Ω/cm2)。
1.2仪器 LC-30AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)，由中央控制器、自动进样器(带制冷功能)、在线脱气机、二元高压输液泵、柱温箱组等成；
ATRAP 6500质谱仪(美国AB SCIEX公司)，配电喷雾离子源(electron spray ionization,ESI)；
XS105DU十万分之一天平(德国METTLER TOLED公司)；
超纯水Milli-Q系统(美国Millipore公司)。
1.3色谱条件 色谱柱：Kinetex-C18 100A(2.6 μm,50 mm× 4 mm)；
流动相：甲醇-1‰甲酸水溶液(60∶40,v/v)；
流速：0.4 mL/min，等度洗脱；
柱温：40 ℃；
进样量：3 μL。
1.4质谱条件 ESI，正离子模式检测、多离子反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式定量。ESI源喷雾电压为4 500 V；
离子源温度为500 ℃；
碰撞能量(collision energy, CE)分别为19,22 eV；
用于定量分析的离子对分别为m/z 384→141(美罗培南)、m/z 237→194(内标：卡马西平)。
1.5溶液制备 美罗培南对照品溶液：取美罗培南对照品约10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加水溶解、定容，得到0.87 g/L美罗培南储备液，置于4 ℃冰箱中避光保存。分别精密量取一定量的储备液适量，置于10 mL量瓶中，加水定容至刻度，得0.02、1、2、5、10、15、20、30 mg/L美罗培南标准曲线工作液。美罗培南低、中、高3个质控工作液浓度分别为0.2、7、20 mg/L。内标工作溶液制备：取卡马西平对照品约10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解、定容，配置成1.00 g/L内标储备液，于4 ℃冰箱中避光保存、备用。精密量取卡马西平储备液6 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释、定容，配制成0.6 mg/L的内标工作液，于4 ℃冰箱中避光保存、备用。
1.6含药血浆制备 取不同浓度美罗培南对照品储备液适量，用空白血浆稀释得0.02、1、2、5、10、15、20、30 mg/L标准曲线测试液，涡旋30 s，-20 ℃冰箱备用。另取不同浓度美罗培南对照品储备液适量，加空白血浆，配制浓度为0.2、7、20 mg/L的美罗培南低、中、高质控样品，-20 ℃冰箱备用。
1.7样本处理 取血浆样品100 μL，置于2 mL 离心管中，加内标溶液100 μL，涡旋混匀30 s，再加水100 μL，涡旋混匀1 min后，加蛋白沉淀剂乙腈1 mL，涡旋混匀1 min。混匀后置于4 ℃离心机中，1×104r/min离心10 min。取上清液100 μL加纯水900 μL混匀，取100 μL置于进样瓶中，进样3 μL分析。
1.8方法学考察
1.8.1专属性 按1.7样本处理方法，分别取6个不同来源的空白血浆, 加甲醇(代替内标工作液)，得空白血浆色谱图；
另取空白血浆，分别测定：空白血浆+卡马西平、空白血浆+美罗培南+卡马西平、患者血浆+卡马西平。
1.8.2标准曲线及定量下限 取含药标准曲线血浆样品按 “1.7样本处理”方法操作，以美罗培南浓度(x)为横坐标，美罗培南与内标卡马西平的峰面积比(y)为纵坐标，采用加权最小二乘法(加权系数为1/x2)进行线性回归。标准曲线最低浓度点为定量下限。
1.8.3精密度与回收率 分别取美罗培南血浆质控样品(0.2、7、20 mg/L)各6份，按“1.7样本处理”方法处理后，进行检测，连续测定3 d，得日内和日间精密度；
分别配制低、中、高3个浓度的美罗培南质控样品各12份，6份用于提取前加入工作液和内标，6份用于提取后加入工作液和内标，进样分析，计算提取回收率。
1.8.4稳定性 考察美罗培南储备液在室温(20 ℃)放置2、4 h，4 ℃冰箱中放置4、6 h，-20 ℃冷冻保存21 d条件下的稳定性。考察美罗培南的低、中、高浓度的血浆质控样品在室温放置2、4 h，样品处理后室温放置(2、4 h)、4 ℃样品托盘(4、6 h)、-20 ℃冷冻保存(12、24 h)，-20 ℃冰箱中循环冻融3次及-20 ℃长期冷冻保存21 d条件下的稳定性。
1.8.5基质效应 分别取6个不同来源的空白血浆100 μL，加乙腈1 000 μL涡旋混合后得空白基质，分别加入低、中、高3个质量浓度质控样品100 μL和内标100 μL，进样分析，得分析物与内标峰面积比值A1。以纯水代替空白血浆，同法操作，得分析物与内标峰面积比值 A2。内标归一化的基质因子=A1/A2×100%。
2.1方法学评价
图1 LC-MS/MS法测定人血浆中美罗培南典型色谱图
2.1.1专属性 方法专属性结果见图1。美罗培南和内标的可完全分离，峰形对称，保留时间分别为1.12 min和2.50 min。空白血浆中内源性物质不干扰目标物的测定。
2.1.2标准曲线和定量下限 血浆中美罗培南浓度在0.02～30 mg/L范围内线性关系良好，回归方程为y=4.934×10-5x+2.083×10-2(r=0.999 9)，定量下限为0.02 mg/L。
2.1.3精密度与回收率 美罗培南的日内、日间RSD<3%，回收率在91.96%～100.97%之间，见表1。
表1 人血浆中美罗培南精密度和回收率Table 1 Precision and extraction recovery of meropenem in human plasma (n=6)
2.1.4稳定性 美罗培南储备液在室温(20 ℃)放置4 h，4 ℃冰箱中放置6 h，-20 ℃冷冻保存21 d稳定。美罗培南血浆质控样品在室温放置4 h，样品处理后室温放置4 h、4 ℃样品托盘放置6 h、-20 ℃冷冻保存24 h、-20 ℃冰箱中循环冻融3次及-20 ℃长期冷冻保存21 d稳定。
2.1.5基质效应 美罗培南低、中、高3个质量浓度的绝对基质效应在93.24%～98.56%，内标卡马西平的归一化基质效应因子为97.82%。结果表明：美罗培南和内标测定不受基质效应影响。
2.2方法应用 结合我院美罗培南细菌耐药检测结果，将美罗培南最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)1 mg/L作为有效血药浓度范围下限，目标浓度范围为1～30 mg/L。197例次脓毒症患者美罗培南血药浓度范围监测结果为0～16.33 mg/L。见表2。
表2 197例次脓毒症患者美罗培南血药浓度Table 2 Plasma concentration of meropenem in 197 sepsis patients
本研究建立了LC-MS/MS法测定脓毒症患者血浆中美罗培南浓度，该方法特异性强、重复性好，样品分析时间为3 min，大大缩短了样品检测时间，能够满足临床监测需求。
在临床实际采样过程中，血液样本常伴有溶血和乳糜血现象，分别考察了轻、中、重度溶血和脂血症对美罗培南检测结果的影响。结果显示：轻、中、重度溶血和脂血症不影响血浆中美罗培南结果测定，但重度脂血症血液样本会给样品前处理带来一定困难。因此，在处理重度脂血症样本时，应给予充分离心和涡旋振荡。同时，考察了枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠作为抗凝剂对美罗培南测定的影响。结果表明：枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠不影响美罗培南和卡马西平测定。
美罗培南血浆蛋白结合率低，主要通过肾脏以原型排泄，患者肌酐清除率显著影响美罗培南的清除率[13]。由于脓毒症患者肝、肾功能的改变，同时伴有多器官功能障碍，使美罗培南在脓毒症患者体内药代动力学参数与健康受试者体内药代动力学参数存在较大差异从而影响到临床疗效[14-15]，所以应对脓毒症患者体内美罗培南血药浓度进行监测，并根据血药浓度监测结果进行给药方案调整。197例次脓毒症患者中，美罗培南血药浓度低于1 mg/L占比为67.0%。因此，脓毒症患者在采用美罗培南治疗过程中，应根据治疗药物监测结果，结合患者性别、年龄、体重、肝肾功能等实际情况给予适当的给药方案调整，以期达到最佳治疗效果。研究表明：美罗培南全血样本在2～6 ℃和室温下放置6 h开始降解，血浆样品处理后3 h稳定[7,10]。本研究稳定性实验表明美罗培南血液样本室温放置4 h、样品处理后4 ℃放置6 h稳定，但美罗培南稳定性差，应在样本采集后尽快完成样本处理、检测，如不能在第一时间进行测定，应将美罗培南血液样本离心后，-20 ℃保存。标准化的美罗培南血液样本采样流程直接影响美罗培南检测结果的准确性。因此，根据实验结果建立了《临床样本采样流程》，并对临床医师和护师进行培训，保证样品采集、存储、转运标准化，进而保证美罗培南血药浓度检测结果的准确性，提高美罗培南治疗脓毒症的有效性，实现从经验治疗到个体化精准治疗的转变。本试验建立了敏感、准确、可靠、简便、快速的美罗培南检测方法，为美罗培南药物的临床监测提供了技术支持。根据美罗培南血药浓度监测结果，实现了临床治疗方案从经验治疗模式向精准的个体化治疗的转变，对提高美罗培南治疗的有效性、有效控制细菌耐药的产生均有重要意义。
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