水产动物抗菌肽及其在水产养殖中的应用研究进展

刘德财，韩学东

（佳木斯大学生命科学学院，黑龙江 佳木斯 154007）

抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）又称宿主防御肽（Host defence peptides,HDPs），是一类分子组成小于80 个氨基酸、具有抵抗外界病原活性的小分子肽，是生物体免疫系统的重要组成部分。抗菌肽最早发现于果蝇的抗菌系统[1]，随后从经大肠杆菌和阴沟杆菌诱导的天蚕蛹血淋巴纯化获得具有抗菌活性的多肽，定名为天蚕素（Cecropins）[2,3]。抗菌肽作为生命有机体的天然免疫防御系统，从低等生物到高等生物都能表达。尽管抗菌肽的种类和化学分子构成不同，但具有共同的性质，如带正电荷、强碱性、分子量小、热稳定性好、广谱抗菌性及不易产生耐药性等特点。近年来，大量滥用抗生素导致病原微生物产生了不同程度的耐药性，制约了水产养殖业可持续性发展[4,5]。抗菌肽作为一种区别于传统抗生素的抗菌物质已经被广泛研究，目前已发现了接近3 000 种动物抗菌肽[6]，在水产养殖领域具有广阔的应用前景。本文将对水产动物抗菌肽种类、作用机制及研究动态、抗菌肽在水产养殖中的应用现状以及存在的问题与对策等进行综述。

1.1 抗菌肽结构

1.1.1 抗菌肽的一级结构

抗菌肽属于小分子肽，一般由10～80 个氨基酸构成，肽链的氮端富含亲水性碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸），而碳端富含中性或弱碱性疏水性氨基酸且常被酰胺化；
通常氮端带正电、碳端呈现电中性。多数抗菌肽一级结构中，第二位通常为色氨酸残基，中间部分富含脯氨酸残基，同时也经常出现由半胱氨酸残基形成的二硫键结构[7]。

1.1.2 抗菌肽的二级结构

根据肽链的空间二级结构，抗菌肽可分为α-螺旋型抗菌肽、β-折叠型抗菌肽、环状结构抗菌肽和延展结构抗菌肽。α-螺旋型抗菌肽是为常见，研究得也较多，在液相中以无序结构存在，当与生物膜接触时，就会呈现具有双亲性α-螺旋的二级结构，发挥其生物学活性，如Piscidins[8]、Gaduscidins[9]和Pardaxin[10]等；
β-折叠型抗菌肽广泛存于海洋无脊椎动物、两栖类动物中。与α 螺旋型抗菌肽不同，β-折叠型抗菌肽含有保守性的半胱氨酸残基，可在肽链中形成较为稳定的二硫键，增加了结构的稳定性，在水相中仍然保持有序的稳定结构[10]，如Cathelicidin[11-13]、Defensins[14,15]、Hepcidin[16,17]等；
环状结构抗菌肽和延展型抗菌肽，一级结构与组蛋白H1、H2 相似，含有较高比例的精氨酸、色氨酸或脯氨酸残基无法折叠成规则的二级结构，如Parasin[18]、HPL-1[19]等。

1.2 抗菌肽作用机制

抗菌肽发挥生物学功能的机制与自身的结构特性密切相关，主要可以分为膜结构破坏模式和非膜结构破坏模式。

1.2.1 膜结构破坏模式

目前认为，绝大多数抗菌肽是通过膜结构破坏模式发挥抗菌作用。抗菌肽基于自身物化性质和结构特征，插入到细胞膜双分子层中，破坏细胞膜的完整性，引起细胞内容物外流甚至膜的破裂，抑制细菌的生物合成和繁殖进而杀灭细菌。膜结构破坏模式主要有四种模型假设，即板-桶模型[20]、地毯模型[21]、环形模型[22]和凝聚模型[23]。抗菌肽理化特性是膜结构破坏的关键，改变抗菌肽的结构可提高其抗菌活性[24-26]。

1.2.2 非膜结构破坏模式

少数抗菌肽可以在不破坏细胞膜结构的情况下，通过渗透作用快速进入细胞膜内部，与细胞膜内的生物活性分子相互结合，影响细菌内部核酸分子、蛋白质的生物合成等生理过程，发挥抑菌或杀菌的生物活性[27,28]。

1.3 生物学功能

1.3.1 广谱抗菌活性

研究表明，大多数抗菌肽具有广谱的（革兰氏阳性和革兰氏阴性）抑制或杀灭细菌的活性。体外抗菌性试验表明，东北林蛙（Rana chensinensis）抗菌肽可抑制革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus）、格兰仕阴性菌（铜绿色假单孢菌Pseudomonas aeruginosa和大肠杆菌Escherichia coli），对其多种耐药菌株仍有抑制作用[29]。尽管抗菌肽的抗菌谱广，但是，也存在差异，如对虾的Penaeidins抗菌肽对革兰氏阴性细菌的抑菌活性就较低[30]。

1.3.2 抗真菌

抗菌肽除了对细菌具有广谱的抗菌作用外，对某些种类的真菌也有一定的抑制杀灭作用。抗菌肽抑制真菌的作用机理多种多样，抑制真菌的主要机制是干扰真菌细胞裂变和细胞壁的形成[31-33]，及通过钙离子内流、钾离子外渗等机制干扰真菌繁殖[32]。

1.3.3 抗病毒

一些抗菌肽能够抑制部分带有包膜的病毒在细胞间的传播[34]，体现抗病毒的活性。抗菌肽与病毒之间有两种抑制关系：一是多种类型的抗菌肽对同一种病毒起作用，另一种是一种抗菌肽可与多种类型的病毒起作用。目前的研究结果表明，抗菌肽对具有包膜结构的DNA 和RNA 病毒的有抗病毒活性要强于无包膜的病毒[33]，如magainin 家族、brevinin-1 家族等的抗菌肽对疱疹病毒、流感病毒等有包膜病毒具有抗病毒活性[35]。

1.3.4 免疫调节作用

并非所有抗菌肽都是通过作用于微生物而发挥生物学活性，有的抗菌肽（如HBD、Cathelicidin等）可以对宿主进行免疫调节，增强有机体的非特异性免疫功能，发挥抑菌功能，如降低细菌内毒素引起的炎症反应、诱导巨噬细胞聚集和促炎症分子的合成等[36-38]。

1.4 抗菌肽来源

抗菌肽广泛分布于多种自然生物中，如植物、昆虫、两栖动物、哺乳动物等。除上述自然界天然抗菌肽外，随着生物技术、酶化学和基因工程的快速发展，人工抗菌肽已成为抗菌肽的发展方向。

1.4.1 天然抗菌肽

天然抗菌肽是由有机体自主产生，通过萃取、浓缩、提纯而获得的抗菌肽，人类获得的第一个天然抗菌肽是天蚕素（Cecropins）。高等动物的抗菌肽主要来源于体内血液细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞[39]，此外在上皮细胞、脂肪细胞和生殖系统中也有分布[12,14,16,29]。

1.4.2 人工抗菌肽

尽管天然抗菌肽的来源丰富，但是含量很低、获取成本昂贵，难以在生产实践中广泛使用，目前获取抗菌素的主要来源是人工制备。较为成熟的人工制备抗菌肽的方法有三种：一是根据抗菌肽氨基酸序列，通过化学合成的方法获得抗菌肽[40-43]；
二是通过基因工程技术，将编码抗菌肽的基因导入到表达载体内（酵母、大肠杆菌等），获得产量较高的抗菌肽[41,42]；
三是通过蛋白酶催化水解特定蛋白质（牛乳铁蛋白、卵白蛋白和乳酪蛋白等）获得具有抗菌活性的多肽[44-47]。

2.1 水生无脊椎动物抗菌肽

贝类、甲壳类等水生无脊椎动物特异性免疫系统，主要依靠先天免疫系统抵御外界微生物的侵害。水生无脊椎动物体内含有丰富的防御黏液，其中富含抗菌肽，能够帮助水生无脊椎动物抵御病原微生物的侵害，因此抗菌肽对于缺少特异性免疫系统的无脊椎动物具有更为重要的意义。

2.1.1 水生贝类

在水生贝类抗菌肽的研究中，有关贻贝抗菌肽的研究较早且较为透彻[48]。贻贝抗菌肽的氨基酸组成中半胱氨酸含量丰富，生理状态下带有正电，依据多肽的一级结构特征可分为四类：贻贝素（Mytilins）、防御素（Defensins）、贻贝肽（Myticins）和贻贝霉素（Mytimycins）[48]。贻贝素属于血细胞和血清的抗菌肽，是贻贝中发现种类最多含量最大的抗菌肽家族，在地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）、厚壳贻贝（M.coruscus）和紫贻贝（M.edulis）等主要贻贝中均有发现。主要包含五种类型：Mytilin A、Mytilin B、Mytilin C、Mytilin D 和Mytilin G1，每种类型对细菌和真菌的抗菌性表现出不同活性，其中Mytilin B 和Mytilin D 具有广谱抗菌性（包括真菌）；
Mytilin C 和Mytilin A 对革兰氏阳性和阴性菌都有效果，而MytilinG1 只对革兰氏阳性细菌有抗菌活性[49]。MGD 1、MGD 2、Mytilus defensins A 和Mytilus defensins B 等贻贝防御素具有典型带正电的疏水性侧链，对革兰氏阳性菌具有特异性的抗菌活性[50]。贻贝肽已经鉴定到Myticin A、Myticin B 和Myticin C三种[49,51]。它们主要分布在血液细胞和血浆中，而Myticin C 是一种分子多态性高的抗菌肽[51,52]。贻贝霉素的功能核心是由十六个半胱氨酸残基所构成，具有严格意义上的抗真菌活性[53,54]。

除贻贝抗菌肽以外，牡蛎、蛤类、盘鲍（Haliotis discus）等水生贝类的抗菌肽研究也逐渐增多。在牡蛎抗菌肽中已鉴定出大防御素家族（Big defensins）。该类抗菌肽结构特征是包含一段由六个半胱氨酸残基组成的高度疏水氮端区域和三个二硫键阳离子碳端区域[55]。青蛤（Cyclina sinensis）闭壳肌表达Mytimacin 成熟肽，在外套膜具有最高的表达量，具有较强的抑制微生物活性[56]。通过多步高效液相色谱结合质谱分析,在马氏珠母贝（Pinctada martensii）血清中鉴定到分子质量在5 kDa 的具有抗菌活性的多肽，通透射电镜观察其抑菌作用机制[57]。在盘鲍肝脏中获得由42 个氨基酸残基组成的分子量为4 kDa的抗菌肽，当机体受到革兰氏阳性和阴性细菌刺激会在肝脏中表达[58]。

2.1.2 水生甲壳类

水生甲壳动物抗菌肽的研究始于海岸蟹（Carcinus maenas）血细胞中获得富含脯氨酸、分子量为6.5 kDa的广谱抗菌肽[59]。甲壳类抗菌肽主要分为三类：对虾素（Penaeidins）、甲壳素（Crustin）和抗脂多糖因子（ALF）。对虾素是一类具有三个二硫键的阳离子抗菌肽，已在多种对虾中发现，如中国对虾（Penaeus chinensis）、斑节对虾（Penaeus monodon）和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）等，其氮端富含脯氨酸和精氨酸、碳段富含半胱氨酸，对革兰氏阳性菌和真菌有较好的抑制效果，但是对革兰氏阴性菌的作用较弱[60-63]；
甲壳素是一类富含半胱氨酸、在碳端含有一个乳清酸蛋白结构的阳离子抗菌肽，分子量7～14 kDa，主要存在于蟹、鳌虾和对虾等甲壳动物中，具有抗病毒、抗菌、抑制蛋白酶活性等功能；
抗脂多糖因子是一种具有脂多糖结合结构的阳离子抗菌肽。该类抗菌肽通过与脂多糖结合激活细胞内的凝血级联反应，具有内毒素结合和广谱抗菌抗病毒活性，已见于斑节对虾、日本囊对虾（Penaeus japonicus）、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）等[64-68]。除以上三类研究较多的抗菌肽之外，近几年在水生甲壳动物中还发现很多新型的抗菌肽，如在拟穴青蟹（Scylla paramamosain）精浆中分离到的阴离子抗菌肽Scygonadin 和SCY2[69,70]、拟穴青蟹血细胞分离到Sphistin 抗菌肽[71]、蜘蛛蟹（Hyas araneu）抗菌肽Arasin[72]和Hyastatin[73]等。

2.2 水生脊椎动物抗菌肽

水产脊椎动物主要有鱼类和两栖类。鱼类最主要，在淡水湖泊、河流和海洋中广泛分布。水环境中富含各种微生物，严重威胁鱼类健康。抗菌肽作为非特异性免疫因子可以有效保护鱼类免受病原微生物的侵害。两栖类动物长期生活在温暖潮湿的环境中，皮肤裸露于环境中，易受病原微生物的影响，在长期进化中两栖动物的天然免疫系统能够产生种类丰富的抗菌肽。

2.2.1 鱼类

按照结构特点鱼类抗菌肽可分为两大类，一类是不含半胱氨酸具有疏水性或双亲性α 螺旋结构的抗菌肽，包括Piscidins、Pleurocidins 和Misgurins等；
另一类是含有多个半胱氨酸β 折叠结构的抗菌肽，如Hepcidin、Cathelicidins 等。

Piscidins 类抗菌肽是鱼类中最常见的抗菌肽家族之一。这个家族成熟肽富含组氨酸和苯丙氨酸，长度一般为18～26，目前已在莫桑罗非鱼（Tilapia mossambica）、条纹鲈（Morone saxatilis）和条石鲷（Oplegnathus fasciatus）中发现5 个亚型，主要在鳃、皮肤和肠表达，除了具有广谱抗菌性外，还具有抗真菌、抗寄生虫和抗病毒的活性[74-76]。

Defensin 类抗菌肽含有18～45 个氨基酸残基，呈阳离子，其中包含6～8 个保守的半胱氨酸，具有广谱的抗微生物活性。鱼类的Defensin 抗菌肽均属于β-Defensin 亚型，在斑马鱼、虹鳟等鱼的肝脏、肌肉、皮肤、肠道和鳃等多种组织中表达[14,15,77]。

Hepcidin 又称铁调素是一种富含半胱氨酸的抗菌多肽，其前肽含有85 个氨基酸残基，包含信号肽、前肽和成熟肽三部分。前肽转化酶通过识别Hepcidin 的碳端高度保守的R-X-K/R-R 结构进行前肽酶切，形成有活性的成熟Hepcidin 抗菌肽[78]。鱼类Hepcidin 可抑制革兰氏阳性和阴性细菌、病毒、寄生虫，还作为免疫调节因子调控鱼类的免疫功能，参与肝细胞和巨噬细胞铁释放的调控[16,17,79]。

Cathelicidins 是一种含有多脯氨酸型结构域（Cathelin 结构域）的阳离子抗菌肽，成熟肽氨基酸残基的长度在12～80。该类抗菌肽在鳃、肝脏、脾脏和肠道的上皮组织中均有表达，具有广谱的杀菌作用[11-13]。

2.2.2 两栖类动物

两栖类动物的皮肤需要时刻保持湿润状态，保持呼吸功能。这种潮湿裸露的皮肤特点为病原微生物的生存提供了极好的环境。为提高生存能力两栖动物形成了强大的皮肤抗菌肽免疫体统，主要包括Bombinins、Cathelicidins、Esculentins 和Temporins 等抗菌肽。

Bombinins 抗菌肽最早在东方铃蟾（Bombina orientalis）皮肤中鉴定到。该类抗菌肽分为BLPs 抗菌肽和H 型Bombinins 抗菌肽，是α 螺旋二级结构的双亲性阳离子抗菌肽。这两种抗菌肽来源于共同的前体，通常由于氮端的第二个氨基酸手性的不同而形成抗菌肽的同分异构体。BLPs 抗菌肽有25～27个氨基酸组成，对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌有活性。H 型Bombinins 抗菌肽由17～20 个氨基酸组成，杀菌活性低于BLPs 抗菌肽，但是，溶血活性高于BLPs 抗菌肽[80,81]。

所有脊椎动物都有Cathelicidins 抗菌肽家族，也是两栖类动物重要的抗菌肽。两栖动物的Cathelicidins 抗菌肽的生物合成与其他有脊椎动物存在一定差异。两栖动物主要通过类胰蛋白酶切割，使前体肽成为成熟肽。两栖动物Cathelicidins 抗菌肽除具有高效广谱的抗菌活性，还具有如抑制组织损伤和促进血管生成等多种重要生物活性，已在中国大鲵（Andrias davidianus）、中华蟾蜍（Bufo gargarizans）和牛蛙（Rana catesbiana）等14 种两栖动物中鉴定到该家族抗菌肽[82]。

Temporin 属于α 螺旋双亲性的阳离子抗菌肽，氨基酸序列长度较短，通常为13 个氨基酸，在中性pH 下具有较低的净正电荷，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均有抑菌活性[82]。该类抗菌肽的抗菌活性已在多种蛙类中鉴定和研究，其中Temporin A、B 和L 抗菌肽中研究最多的是Temporin 类抗菌肽。Temporin A 氮端疏水残基和5、12 位大量疏水残基是抑菌活性的重要决定因素，其对革兰氏阳性菌抗菌活性较高。Temporin L 具有较高的抗菌活性，特别是对真菌病原体和革兰氏阴性菌[82]。

3.1 提高生长性能

饲料系数、特定生长率与增重率是体现水产动物生长的关键指标。饲料中添加一定比例的抗菌肽可明显提高水产动物的生长性能。董晓庆等[83]在饲料中添加400 mg/kg 天蚕素，建鲤鱼种的增重率增高（P＜0.05）、饲料系数降低（P＜0.05）。王自蕊等[84]发现，饲料中添加150 mg/kg 天蚕素抗菌肽，湘云鲫的增重率和特定生长率提高了37.4%和27.5%（P＜0.05）。陈冰等[85]通过8 周的生长实验表明，添加家蝇幼虫抗菌肽提取物在2 000～3 000 mg/kg 范围内时，使初始体质量0.86 g 的凡纳滨对虾增重率、饲料效率和特定生长率显著提高（P＜0.05）。Zhou 等[86]将10 mg/kg、15 mg/kg 和30 mg/kg 的蜜蜂抗菌肽（Apidaecin）添加到建鲤基础饲料中，饲料转化率与生长性能较对照组显著升稿（P＜0.05）。上述研究证实，饲料中添加抗菌肽可以提升水产动物的生长性能，但是，其功效水平与应用计量、动物种类、个体大小、抗菌肽种类等因素有关。

3.2 提升免疫功能及抗氧化能力

水产动物的免疫功能主要包括特异性免疫和非特异性免疫。抗菌肽能够提升水产动物血液中溶菌酶、超氧化物歧化酶和磷酸酶等的非特异性免疫因子活性，增加机体免疫力，提升机体对有害病原体的防御能力。胡世康等[87]、柴仙琦等[88]均验证：饲喂添加抗菌肽的饲料可以显著提升凡纳滨对虾血清中超氧化物歧化酶、溶菌酶和碱性磷酸酶的活性（P＜0.05）。姜珊等[89]在吉富罗非鱼饲料中添加重组中国对虾抗菌肽,并于实验结束时注射嗜水气单胞菌攻毒，结果添加5 mg/kg 抗菌肽可以显著提高罗非鱼过氧化物酶体的活性,存活率最高（P＜0.05）。给锦鲤（Cyprinus carpio haematopterus）[90]、银鲫（Carassius auratus gibelio）[91]、花鲈（Lateolabrax japonicus）[92]和河蟹（Eriocheir sinensis）[93]饲喂添加抗菌肽饲料，均表现出抗氧化能力和免疫功能的提升。

3.3 促进水产动物肠道健康

外源性抗菌肽主要通过饲料进入水产动物消化系统，与肠道微生物相互作用影响水产动物的肠道健康。抗菌肽可从肠道菌群、肠道组织结构和肠道消化酶活性三个方面影响肠道健康。苏保元[94]比较了两种抗菌肽对斜带石斑（Epinephelus coioides）鱼肠道菌群的影响。结果表明：添加抗菌肽均能增加斜带石斑鱼肠道内总菌和乳酸菌数量、降低致病性弧菌数量，其中天蚕素的效果更好。翟少伟等[95]研究表明：添加不同水平Surfactin 抗菌肽均能显著增加吉富罗非鱼肠道肠黏膜的相对表面积、皱褶高度，促进肠道吸收功能，其中50 mg/kg 组肠道褶皱高度较对照组增加了0.7 倍。饲料中添加抗菌肽还能显著提高吉富罗非鱼和鲤（Cyprinus carpio）肠道脂肪酶和蛋白酶的活性[96,97]。

随着高密度、集约化水产养殖的发展，在过度使用抗生素的背景下，寻求抗生素替代物成为当下的趋势[98]。研究和应用抗菌肽可有效降低水产养殖中抗生素的滥用，改善水产品的品质，促进水产养殖业绿色健康发展。抗菌肽虽然具有诸多优点，如分子量小、广谱抗菌性、不易产生耐药性和较好的食品安全性等，但仍存在着亟待解决的问题。一是提高获取抗菌肽的能力。从生物体直接提取纯化抗菌肽，含量低、资源受限、成本高，无法大规模批量生产。通过化学合成的方式制备小分子抗菌肽，难以保持抗菌肽的活性构象，合成成本较高。蛋白酶水解抗菌蛋白可以大批量、低成本地获取具有抗菌活性的水解产物，但水解产物中非抗菌活性产物较多，使用安全性难以完全掌控。利用基因工程方法获取抗菌肽，表达载体菌容易分泌蛋白酶使抗菌肽降解，同时抗菌肽的产生会抑制甚至杀灭表达载体菌。二是提高抗菌肽的抗菌活力。抗菌肽虽然能够替代抗生素预防水产动物疾病，但抗菌肽的抗菌谱及活力与传统抗生素的抗菌效果还有差距。三是抗菌肽药用机理问题。在水产养殖临床应用上，缺乏深入的对抗菌肽的毒理性及药理药效研究，特别是在使用剂量、给药方式和作用时间等内容还需要深入研究。因此，加快对应用于水产养殖领域抗菌肽的制备、饲料添加量等方面的研究迫在眉睫，这将对水产养殖业的可持续发展起到重要的作用。

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