柱前衍生-高效液相色谱法测定婴幼儿食品和乳品中胆碱含量
时间：2023-02-28 11:05:07 来源：千叶帆 本文已影响人
卢越圻， 孙 洁*， 金志浩， 薛 麟， 袁雯菲
1.中检科(上海)测试技术有限公司，上海 201206；
2.通标标准技术服务(上海)有限公司，上海 200233
胆碱具有促进大脑发育、促进神经系统的信息传递等功能[1]。胆碱通常是以氯化胆碱或酒石酸胆碱的形式添加到婴幼儿配方食品中的。我国食品安全国家标准GB 10765—2010[2]、GB 10767—2010[3]等对婴幼儿配方食品和其他食品中胆碱的含量有明确的限量规定。目前对食品中胆碱含量的检测主要包括雷氏盐比色法[4]、酶比色法[4-6,11]、离子色谱法[11]、HPLC-MS法[7,11]、HPLC-ELSD法[8]、UPLC-FLD法[9,10]等。其中酶比色法(如国标GB 5413.20—2022第一法)使用较多、较为经典，但是成本高、效率低、背景干扰因素较多，且不适用于试样中维生素C含量大于100 mg/100 g的样品[6]，现有的国标和文献里暂时未出现使用本方法用于胆碱的测定，因此本文首次尝试使用高效液相色谱法测定胆碱含量，弥补国标方法检测胆碱含量成本高、耗时长、工作量大、维生素C等还原性成分过高影响检测等方面的不足。
1.1 仪器与试剂
胆碱酒石酸氢盐标准品(Dr.)、芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)、乙腈(色谱纯)、硼酸、氢氧化钠、磷酸(优级纯)、正己烷(色谱纯)、十二水合磷酸氢二钠(色谱纯)、十水合四硼酸钠(色谱纯)、盐酸(优级纯)(除注明外均为分析纯)。衍生剂：10 mg/mL的Fmoc-Cl乙腈溶液。缓冲液：0.4 mol/L的硼酸钠缓冲液(pH 11.0)。流动相A：十二水合磷酸氢二钠9.0 g，十水合四硼酸钠9.5 g，加水2 L，用盐酸调pH至8.2。流动相B：乙腈。
赛默飞液相色谱仪U3000配荧光检测器、日本岛津RF-6000荧光分光光度计。
1.2 色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 Column(4.6 mm×250 mm，5 μm)；
流动相：流动相A∶流动相B=65∶35；
流速：1.0 mL/min；
检测波长：荧光波长：激发波长265 nm，发射波长315 nm；
柱温：40 ℃；
进样量：4 μL(程序进样)。
1.3 标准曲线的制作
胆碱(以胆碱氢氧化物计)标准储备溶液(2 500 mg/L)：称取在102 ℃±2 ℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐522.5 mg，用水溶解并转移至100 mL容量瓶中定容，混匀。继续用水逐级稀释成1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的标准曲线。
1.4 样品的测定
称取5 g～10 g混合均匀的试样，于100 mL的锥形瓶中，加入30 mL 1 mol/L盐酸溶液。将装有试样的容器放在70 ℃水浴中，加塞混匀，水解3 h(每隔30 min振摇一次)，冷却。用氢氧化钠溶液调pH为5.5～6.0，转入50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，过滤水解液，胆碱浓度太大时稀释至标曲范围内。同时做空白试验。
2.1 衍生条件的优化
2.1.1衍生终止剂和萃取剂
用正己烷萃取水解产物等杂质，样液比为试样溶液∶缓冲液∶衍生试剂∶衍生终止剂(0.1%的磷酸溶液)∶正己烷=400 μL∶200 μL∶200 μL∶200 μL∶2 mL(×3次)，在室温下衍生，衍生时间为5 min。使用1.2液相条件，进样量10 μL。试验结果显示：1)使用衍生终止剂对结果的影响较大，会使结果偏小；
2)使用正己烷萃取过量的Fmoc-Cl及其水解产物FMOC-OH(随着衍生时间的增加反应会趋向于Fmoc-Cl的水解，其产物为FMOC-OH)的同时会萃取一定量的衍生物，导致结偏小。因此确定，衍生的比例为试样溶液∶缓冲液∶衍生试剂=2∶1∶1，不使用衍生终止剂和正己烷。
2.1.2正交试验分析
在此基础上，以20 μg/mL的工作液色谱峰面积为评价指标，设计L18(37)正交试验，对硼酸缓冲液pH(A)、衍生剂浓度c(B)、衍生温度T(C)和衍生时间t(D)4个影响因素进行考察，每个因素选取三个水平，考察各因素的主次影响顺序和最优水平组合。实验操作步骤同2.1.1。正交试验因素见表1、正交试验数据分析结果见表2。
表1 胆碱衍生化条件因素水平表
表2 胆碱衍生化条件正交试验数据分析结果
通过极差分析，各因素的主次顺序为A>B>C>D，可初步得出的最优方案为A3、B3、C2、D3。进一步的方差分析显示四个因素F值均不显著(p>0.05)，这可能是由于误差自由度过小，分析的灵敏度不够高的缘故。对主要因素A、B用LSR法进行多重比较，得到以A3、B3为最好。综合极差分析和方差分析结果，本试验的最优处理组合为A3、B3、C2或C3、D3或D1，本文选用A3、B3、C2、D3，即硼酸缓冲液pH为11，衍生剂浓度10 mg/mL，衍生温度30 ℃，衍生时间15 min。
2.2 色谱条件的优化
实验操作步骤同2.1.1，优化色谱条件。
2.2.1检测波长的确定
使用紫外检测器对衍生物进行全波长扫描，综合考虑灵敏度、基线波动、其他杂质组分被检测出的可能性，最终选择265 nm为紫外检测波长。在此基础上，以265 nm为激发波长，利用荧光分光光度计扫描确定最佳激发波长。通过扫描发现在315 nm处响应最大，故确定发射波长为315 nm。因此，荧光检测波长选用激发波长为265 nm，发射波长为315 nm。由于在试验中发现选用紫外检测器测定胆碱衍生物时响应很小，不利于定量，因此在实际测定时选用荧光检测器检测。
2.2.2流动相的选择
考察不同流动相比例下的色谱峰分离情况。结果显示，在流动相A比例大于70%的情况下，未检测到衍生物组分，说明衍生物组分不能被洗脱；
而流动相A比例小于50%的情况下，衍生物组分的保留时间小于5 min，因此综合考虑实际样品中各组分分离度和检测时间，确定选择流动相为A∶B=65∶35。
2.3 方法学验证
2.3.1衍生产物的专属性
分别吸取空白溶液、20 μg/mL胆碱工作液、一奶粉样品水解处理溶液各400 μL，实验操作步骤同2.1.1。结果表明，试样中胆碱经衍生化反应后其色谱峰理论塔板数能够达到14 000，分离度能够达到2.3，拖尾因子能够达到1.1，空白在保留时间处无干扰，说明C18色谱柱对其有较好的分离效能，胆碱衍生物与其他被分离物质的分离程度好，胆碱衍生物的色谱峰略有拖尾，但对试验影响不大。综上所述，该方法专属性较强，可以用来测定胆碱的含量。
2.3.2衍生产物的稳定性
吸取20 μg/mL胆碱工作液400 μL，实验操作步骤同2.1.1，每20 min测定一次，考察在室温下衍生溶液的稳定性。结果表明，衍生物性质不稳定，需要在衍生结束后立即测定。因此为了保证衍生物的稳定测定以及批量测定，研究使用HPLC的程序进样功能实现柱前自动衍生。结合之前的试验结果和仪器特性，对UdpMixWait程序的设置做了考察，UdpMixWait是4 min～30 min，按照试样溶液∶缓冲液∶衍生试剂=2 μL∶1 μL∶1 μL进行衍生，使用1.2液相条件。结果显示，UdpMixWait在20 min之后衍生物峰面积开始逐渐变小，说明衍生物开始分解，结合2.1所确认的衍生条件以及实际样品测定的可行性，最终确定15 min较为合适。
利用以上确定的程序进样条件对20 μg/mL的胆碱工作液进行测定，参考JJG 705—2014[12]的相关要求，考察其定性、定量重复性。结果表明，衍生产物的定性重复性为0.15%、定量重复性为2.43%，达到了预期效果，利用程序进样对目标物进行衍生的操作是可行的，保证了衍生物的稳定测定以及批量测定的可能性。
2.4 线性关系、最低检出限、定量限
标准曲线：对1.3的标准曲线进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，胆碱浓度在1 μg/mL～20 μg/mL的范围内有较好的线性关系，回归方程为y=311 343.549 7x+347 196.959 4，相关系数R2=0.999 7。20 μg/mL的胆碱衍生物的色谱峰见图1。
图1 胆碱衍生物色谱图
最低检出限、定量限：结果显示0.3 μg/mL及1 μg/mL的胆碱工作液的S/N分别为7.255及17.117，能达到3 S/N及10 S/N，按照称样量为5 g，定容体积为50 mL，计算出方法的LOD为0.3 mg/100 g、LOQ为1 mg/100 g。
2.5 回收率及精密度实验
在2.1、2.2、2.3实验条件下，对4个不同样品分别添加低、中、高三个浓度水平的标样，进行三水平六平行加标回收实验，计算平均值、测定回收率及精密度，其中奶粉2维生素C含量大于100 mg/100 g。结果显示，各样品的平均加标回收率为 85.0%～110.4%，相对标准偏差(RSD)为1.27%～3.78%，结果见表3。
表3 方法回收率、精密度测定结果(n=6)
2.6 本方法与国标的比较
用国标GB 5413.20—2022(第一法 酶比色法)与本方法对3个不同样品分别进行测定，并且分别对样品进行两向分组有相等重复观测值试验资料的方差分析，以国标测定数据为基准，比较两个检测方法的数据差异，结果见表4及表5。结果表明，本法和国标相比，同一样品不同方法数据间差异不显著(p>0.05)，本法的测定数据是可以接受的，说明本法能较为有效的测定样品中胆碱的含量。
表4 本法和国标测定样品数据对比
表4(续)
表5 本法和国标测定样品数据方差分析表
本文通过正交试验得到利用Fmoc-Cl衍生胆碱的最佳条件，利用高效液相色谱仪的程序进样功能实现在线衍生，首次建立了使用高效液相色谱-荧光检测器测定胆碱含量的方法。利用该方法建立的标准曲线线性良好，LOD为0.3 mg/100 g、LOQ为1 mg/100 g。样品平均加标回收率为85.0%～110.4%，RSD为1.27%～3.78%。相比于传统的酶解法，本法在试剂成本上可以降低90%，在样液制备完成后省去了酶解、紫外上机等人工操作的时间；
目标物与其他杂质可被C18柱有效分离。通过比较本方法和国标GB 5413.20—2022第一法对相同样品进行测定的数据，结果显示两种方法的数据间差异不显著(p>0.05)，本法能有效对样品进行胆碱的测定。
