植物甾醇α-亚麻酸酯的制备及在负载虾青素脂质体中的应用
时间：2023-03-27 08:55:02 来源：千叶帆 本文已影响人
刘彦君 潘 丽 常振刚 孟豪杰 张国治
(1. 河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001；
2. 河南金谷实业发展有限公司，河南 郑州 450003)
虾青素广泛存在于自然界中，是一种酮式类胡萝卜素，具有抗癌、抗炎[1]、抗氧化[2]、保护皮肤[3]等多种生理功能。然而，虾青素水溶性差，易受到光、氧、热等外界条件的影响，容易被氧化、异构化和降解，从而导致生物利用度低[4]。
脂质体是由两亲性的磷脂分子组成的球状小囊泡，能够包埋亲水性、亲脂性或两亲性分子，具有缓释调控作用[5]。将虾青素包埋在脂质体中，可以提高虾青素的稳定性、水溶性和生物利用度[6]。但脂质体在存放过程中容易发生聚集和融合等问题，传统脂质体中通常会添加胆固醇，因为胆固醇可以调节脂质体膜的流动性、通透性，具有提高脂质体膜稳定性的作用[7-9]。然而，胆固醇含量过高会引发一些健康问题。植物甾醇与胆固醇具有相似的结构，也能调节脂质体膜的性质，如酰链顺序、弹性和侧向组织[10]，并且可以降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白水平，具有良好的抗炎、抗氧化及抗癌等生理作用[11-13]。然而，植物甾醇具有高熔点(135 ℃)，并且在水相和油相中的溶解度极低，这导致其难以被直接应用[14-15]。
将植物甾醇和脂肪酸进行酯化反应是提高植物甾醇脂溶性的有效方法之一。α-亚麻酸是一种人体必需脂肪酸，具有降血脂、抗癌和抗过敏等生理作用，但是由于含有3个不饱和双键，稳定性较差[16]。以植物甾醇和α-亚麻酸为原料制备植物甾醇α-亚麻酸酯，用于负载虾青素的脂质体的构建，不仅能够发挥植物甾醇和α-亚麻酸的双重生理功效，降低α-亚麻酸的氧化速度，提高其稳定性，而且可以提高植物甾醇的脂溶性，拓宽植物甾醇的应用范围。目前，国内外关于使用植物甾醇酯构建负载功能因子的脂质体的研究尚处于初步探索阶段。Hou等[17]以大豆磷脂为原料，采用薄膜—超声法制备了植物甾醇丁酸酯脂质体，发现植物甾醇丁酸酯可以提高脂质体的贮藏稳定性、增加疏水烷基链的有序度及提高脂质体膜的热稳定性等。
研究拟以植物甾醇和α-亚麻酸为原料制备植物甾醇α-亚麻酸酯，采用薄膜—超声法，以大豆磷脂为主要膜材，构建虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体，研究其包封率、粒径大小及分布、zeta电位与微观形貌等理化性质，考察虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的潜在优势，为植物甾醇酯应用于脂质体的构建提供理论依据。
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
α-亚麻酸游离酸：纯度80%，河南利诺生化有限责任公司；
植物甾醇：纯度95%，宜春大海龟生命科学有限公司；
硅胶：60～100目，青岛海洋化工有限公司；
虾青素：纯度98%，上海研域商贸有限公司；
大豆磷脂：纯度98%，沈阳天峰生物制药有限公司；
无水乙醇、正己烷、乙醚、石油醚：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；
三氯甲烷：分析纯，洛阳市化学试剂厂；
乙酸：分析纯，西陇科学股份有限公司；
硫酸氢钠：分析纯，郑州派尼化学试剂厂；
吐温80：化学纯，天津市鼎盛鑫化工有限公司。
1.1.2 主要仪器设备
电子分析天平：AUY120型，岛津国际贸易(上海)有限公司；
超导核磁共振仪：Bruker Avance 400 MHz型，瑞士布鲁克公司；
气相色谱仪：GC-2010型，岛津企业管理(中国)有限公司；
傅立叶变换红外光谱仪：PerkinElmer Spectrum TWO型，美国铂金埃尔默股份有限公司；
超声乳化分散器：JY92-IIN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；
旋转蒸发器：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；
紫外可见分光光度计：T6新世纪型，北京普析通用仪器有限责任公司；
马尔文激光纳米粒度仪：Zetasizer Nano ZS90型，英国马尔文仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 植物甾醇α-亚麻酸酯的合成 参照张品[18]26-27的方法并稍作修改：称取30 g质量比为1∶2的植物甾醇和α-亚麻酸于250 mL的三口烧瓶中，油浴加热至样品溶解，加入2%的硫酸氢钠，130 ℃恒温反应8 h后，冷却至室温，进行水洗和醇洗，以除去催化剂和未反应的α-亚麻酸。
1.2.2 植物甾醇α-亚麻酸酯的硅胶柱层析分离 采用硅胶柱层析法，湿法装柱。洗脱剂为正己烷—乙醚—乙酸混合液(V正己烷∶V乙醚∶V乙酸=90∶10∶1)，填料高度为35 cm，洗脱速度为1.5 mL/min，每根试管的接收体积为10 mL。
1.2.3 植物甾醇α-亚麻酸酯的薄层色谱分析 薄层硅胶板在使用前置于烘箱中110 ℃活化1 h。将样品用正己烷稀释后，使用毛细管在薄层硅胶板上均匀点样。在层析缸中加入配制好的洗脱剂，放入点样后的薄层硅胶板，约20 min后取出，置于碘缸中显色。
1.2.4 植物甾醇α-亚麻酸酯的气相色谱测定 色谱柱为DB-5色谱柱；
进样量1.0 μL；
载气(N2)流速50 mL/min；
进样温度300 ℃；
检测器温度350 ℃；
柱压68 950 Pa；
分流比50∶1；
空气流量400 mL/min；
氢气流量40 mL/min；
升温程序200 ℃保持1 min，30 ℃/min升至300 ℃，保持15 min。
1.2.5 植物甾醇标准曲线 参照陈茂彬[19]的方法，以角鲨烷为内标物，分别得到植物甾醇中各组分的标准曲线方程见表1。
1.2.6 植物甾醇α-亚麻酸酯纯度测定 先对样品进行皂化处理：称取0.150 0～0.200 0 g纯化后的植物甾醇α-亚麻酸酯和0.030 0 g内标物角鲨烷于100 mL圆底烧瓶中，加入2 g氢氧化钠和30 mL无水乙醇，置于磁力搅拌器中，79 ℃冷凝回流3 h，用超纯水水洗并用正己烷萃取直至下层水相呈中性。取上层有机相清液进行气相色谱测定，根据标准曲线计算得出植物甾醇α-亚麻酸酯的纯度。
表1 植物甾醇的标准曲线方程†
†y为植物甾醇中某甾醇的峰面积与内标物峰面积之比；
x为植物甾醇中某甾醇与内标物的质量之比。
1.2.7 植物甾醇α-亚麻酸酯红外光谱分析 运用傅立叶变换红外光谱仪对植物甾醇和纯化后的植物甾醇α-亚麻酸酯产品进行分析。采用全反射光谱测定法，扫描范围为4 000～400 cm-1，仪器分辨率4 cm-1，扫描次数16次。
1.2.8 植物甾醇α-亚麻酸酯核磁共振分析 取少量纯化后的植物甾醇α-亚麻酸酯，溶解于氘代氯仿(CDCl3)中，利用核磁共振仪分析植物甾醇α-亚麻酸酯的核磁共振1H谱和13C谱。
1.2.9 虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的构建
采用薄膜—超声法构建虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体，参照Pan等[20]的方法并稍作修改：称取200.0 mg 大豆磷脂、20.0 mg植物甾醇α-亚麻酸酯和4.0 mg 虾青素溶解于三氯甲烷中，避光旋蒸(50 ℃、60 r/min)除去三氯甲烷，加入含有Tween-80的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)洗膜15 min，形成脂质体混悬液后迅速冷却，进行冰水浴超声(180 W，5 s开，5 s关)，超声4 min 后即得虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体。
1.2.10 虾青素标准曲线 参照Pan等[20]的方法，采用分光光度计法绘制标准曲线，得标准曲线方程为：y=0.140 3x-0.000 9(R2=0.999 9)。
1.2.11 包封率的测定 参照Pan等[21]的方法，按式(1)计算包封率。
EE=[(M0-M1)/M0]×100%，
(1)
式中：
EE——脂质体对虾青素的包封率，%；
M0——脂质体中虾青素的总质量，mg；
M1——脂质体中游离虾青素的质量，mg。
1.2.12 粒径大小及分布、zeta电位的测定 采用马尔文激光纳米粒度仪测定虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的粒径大小及分布、zeta电位。测定时将脂质体样品稀释200倍，测定温度为25 ℃。
1.2.13 透射电子显微镜观察 参照Pan等[21]的方法运用透射电子显微镜观察虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的微观形貌。
2.1 产物分离纯化
薄层色谱法主要是根据混合物中各组分的极性间的差异，从而使极性不同的物质能够分离。以正己烷—乙醚—乙酸混合液(V正己烷∶V乙醚∶V乙酸=90∶10∶1)作为展开剂对反应底物和反应产物进行薄层层析分离，结果如图1所示。植物甾醇与α-亚麻酸进行反应后有新物质生成，新物质的扩散速度比植物甾醇和α-亚麻酸快，说明新物质的极性小，因此初步判定新物质为植物甾醇α-亚麻酸酯[22]。从图1可以看出，经过数次醇洗已洗去大量未反应的α-亚麻酸，得到的粗产品中只含有少量α-亚麻酸及一些因酯化反应高温而产生的杂质。植物甾醇的斑点颜色较浅，这是由于植物甾醇的溶解度低。经过柱层析分离纯化后得到的目标产物基本不含其他杂质，且斑点颜色较深，说明经过柱层析纯化后大大提高了植物甾醇α-亚麻酸酯的纯度。
A. α-亚麻酸 B. 植物甾醇 C. 粗产品 D. 植物甾醇α-亚麻酸酯纯化产品
2.2 样品纯度分析
植物甾醇气相色谱图如图2所示。植物甾醇各组分的结构相似、性质相近，区别主要是侧链结构不同。菜籽甾醇极性相对较强，最先出峰；
β-谷甾醇极性最弱，最后出峰；
豆甾醇和菜油甾醇的极性接近，因此出峰时间也较为接近[18]34-35。通过查阅文献[23]，确定图2中峰号1～4分别为菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇。图3为皂化后植物甾醇α-亚麻酸酯纯化产品(含角鲨烷)的气相色谱图，峰号5～9分别为角鲨烷、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇。将各甾醇与角鲨烷的峰面积比分别代入标准曲线，计算得出植物甾醇α-亚麻酸酯的纯度为(90.72±2.09)%。
1. 菜籽甾醇 2. 菜油甾醇 3. 豆甾醇 4. β-谷甾醇
5. 角鲨烷 6. 菜籽甾醇 7. 菜油甾醇 8. 豆甾醇 9. β-谷甾醇
2.3 植物甾醇α-亚麻酸酯的红外光谱分析
红外光谱可以用于鉴定植物甾醇及其酯衍生物的分子结构。图4中的曲线a，在1 055 cm-1和3 427 cm-1处分别是植物甾醇的C—O键的伸缩振动吸收峰和—OH键伸缩振动吸收峰[24]106-114；
2 865 cm-1和2 934 cm-1分别是—CH2和—CH3的碳氢伸缩振动吸收峰，1 375 cm-1和1 461 cm-1处分别是—CH3和—CH2的碳氢弯曲振动吸收峰[25]。在图4中观察到植物甾醇α-亚麻酸酯的红外光谱中不存在—OH键的伸缩振动吸收峰，表明纯化后的产品不含醇或者有机酸；
同时，图4中的曲线b在1 734 cm-1处出现了强烈的酯羰基(C═O)的特征吸收峰，1 171 cm-1处存在C—O—C的强吸收峰，说明有酯键生成[26]。以上结果表明纯化后的产品是植物甾醇α-亚麻酸酯。
a. 植物甾醇 b. 植物甾醇α-亚麻酸酯
2.4 植物甾醇α-亚麻酸酯的核磁共振波谱分析
图5为植物甾醇α-亚麻酸酯的1H谱图。在δ=0.5×10-6～2.5×10-6范围内存在许多重叠的亚甲基氢吸收信号，低于1.0×10-6的信号峰主要是由于甲基基团的共振引起[27]。查阅文献[18]37-38[24]3-20得知δ=7.26×10-6处是CDCl3的溶剂峰位置，观察图5植物甾醇α-亚麻酸酯1H谱图可知，样品中含有烯氢(δ=4.5×10-6～6.5×10-6)，不含羧基氢(δ=9.0×10-6～12.0×10-6)、醛基氢(δ=9.5×10-6～10.0×10-6)及烯醇氢(δ=11.5×10-6～13.5×10-6)，说明样品中不含羟基。
图5 植物甾醇α-亚麻酸酯的1H谱
图6为植物甾醇α-亚麻酸酯的13C谱图。查阅文献[24]35-42得知，酯碳δ为165×10-6～175×10-6，不饱和碳δ为100×10-6～155×10-6，饱和碳δ<55×10-6，CDCl3δ=77.019×10-6。由图6可知，样品中含有酯碳(δ=173.283×10-6)，次甲基与氧结合(δ=73.669×10-6)，表明植物甾醇和α-亚麻酸反应后生成了酯并且酯化位点在植物甾醇六圆环上的一个羟基上。综合以上分析，产物为植物甾醇α-亚麻酸酯。
图6 植物甾醇α-亚麻酸酯的13C谱
2.5 虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的包封率
虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的包封率为(95.00±0.66)%，表明虾青素可以有效地包埋到脂质体中，这可能是因为植物甾醇α-亚麻酸酯的掺入扩大了脂质体囊泡的内部空间，并且与磷脂双分子层相互作用，使脂质体膜结构更稳定，因此制得的脂质体包封率较高[28-29]。
2.6 虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的粒径大小及分布
根据粒径大小可将脂质体分为普通脂质体(1～1 000 nm)和纳米脂质体(1～200 nm)，纳米脂质体具有细胞穿透性、靶向作用等优点[30]，可以提高芯材稳定性，控制释放，提高生物利用度。测得复合脂质体的平均粒径为(158.70±9.70) nm，粒径较小，为纳米脂质体。沈雪[31]制备的虾青素乳状液粒径较大，为194～287 nm，可能是采用的制备方法不同导致的。
多相分散系数(PDI)可以用来表征脂质体的粒径分布均匀性，较小的PDI值表示脂质体样品分布更加均匀[32]。当PDI值大于0.5时，表明脂质体囊泡分布不均匀，体系中可能存在较大的囊泡[33]。粒径大的脂质体囊泡范德华吸引力强，更容易发生聚集和融合，因此体系不稳定[34]。测得复合脂质体PDI值为0.35±0.02，表明制得的虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体囊泡分布较为均匀。复合脂质体的粒径分布图(图7)为单峰形态且呈正态分布，表明该复合脂质体分布均匀、分散性好。
图7 复合脂质体粒径分布图
2.7 虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的zeta电位
zeta电位的绝对值越高，表明脂质体体系越稳定。这是因为当电位绝对值较大时，脂质体的表面电荷高，粒子之间的静电斥力大，因此体系更加稳定，不易发生聚集或融合。一般认为当zeta电位的绝对值大于30 mV时体系是稳定的[35]。测得复合脂质体的平均zeta电位为(-33.87±2.48) mV，表明制得的复合脂质体具有稳定性，脂质体囊泡之间的静电斥力可以有效避免聚集、融合。
2.8 虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的透射电子显微镜观察
如图8所示，虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体粒径大小约为160 nm，脂质体囊泡呈球形，分散均匀，形状规则，与马尔文激光纳米粒度仪的测定结果一致。
图8 复合脂质体的透射电子显微镜图
以植物甾醇和α-亚麻酸为原料制备植物甾醇α-亚麻酸酯，通过柱层析法和薄层层析法进行分离纯化，获得了纯度较高的产物，红外光谱法和核磁共振法证实产物为植物甾醇α-亚麻酸酯。采用薄膜—超声法构建虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体，测得该复合脂质体的包封率较高[(95.00±0.66)%]，马尔文激光纳米粒度仪测定结果显示复合脂质体粒径较小并且分布较为均匀。透射电子显微镜观察显示虾青素—植物甾醇α-亚麻酸酯复合脂质体的微观形貌呈近似球形，形状规则且分散性好，与马尔文激光纳米粒度仪测定结果一致。研究表明植物甾醇α-亚麻酸酯可用于构建脂质体，这为植物甾醇酯应用于负载脂溶性功能因子的脂质体中的构建提供了理论指导。植物甾醇α-亚麻酸酯保留了甾醇的刚性环状结构和烃链分支，掺入脂质体中还可能会引起脂质体稳定性和释放特性等性能的改变，因此，后续应进一步开展相关研究。
猜你喜欢 青素亚麻酸甾醇 高甾醇植物油研究现状食品安全导刊(2022年32期)2022-12-07日粮添加虾青素对种蛋孵化效果的影响中国饲料(2021年17期)2021-11-026000倍抗氧化能力，“完爆”维C！昶科将天然虾青素研发到极致当代水产(2021年6期)2021-08-13虾青素在设施草莓上的应用效果落叶果树(2021年6期)2021-02-12日粮亚麻酸钙对羊肉背最长肌脂肪酸含量的影响中国畜禽种业(2018年8期)2018-09-08α—亚麻酸及其分布食品界(2017年12期)2018-01-20GC-MS/FID法分析玉米胚芽油中的甾醇和甾醇酯中国粮油学报(2017年5期)2017-07-19饲料中添加虾青素对南美白对虾生长、成活率及虾体内虾青素含量的影响广东饲料(2016年4期)2016-12-01毛细管气相色谱法测定黑豆中α-、γ-亚麻酸含量中国粮油学报(2016年1期)2016-02-06美丽速成从“补”开始 LNA亚麻酸孕产期“美肤软黄金”科学之友(2014年24期)2014-03-20 相关热词搜索：制备，负载，植物，
