水基金属加工液中微生物多样性研究

杨 兰， 曾诗琪， 熊 星， 张 婷， 江 鹏， 周晓龙

（1. 中国石化润滑油有限公司上海研究院, 上海 200080；
2. 华东理工大学化工学院石油加工系, 上海 200237）

金属加工液在切削、轧制等金属加工过程中主要发挥着润滑、冷却、清洗和设备防锈等作用[1-2]，其组成主要包括水、基础油和各类化学添加剂。金属加工液的使用费用大约是机械车间生产成本的10%～20%[3]，因此，金属加工液的使用寿命至关重要。然而在实际生产过程中，微生物滋生所导致的污染、腐败问题一直威胁着金属加工液的正常使用。

金属加工液为微生物的生长提供合适的营养源和生长环境[4-5]，同时，微生物又可以通过多种渠道（如水、空气、机械设备或不良的操作习惯等[6]）进入金属加工液。污染的金属加工液中矿物油、乳化剂、油性剂等结构及键能较弱的有机物优先降解，从而降低金属加工液的稳定性[7]。另外，微生物在滋生过程中还会产生有机酸腐蚀机械设备和管道[8]，甚至可以通过加工过程中产生的气溶胶和雾气在空气中传播，因而增加操作人员的患病风险[9-10]。统计数据表明，美国有近120 万相关工人的健康受到影响[11]。在新冠疫情肆虐全球的背景下，增强人类对直接接触的微生物污染源的认知十分必要。

添加杀菌剂是金属加工液控制微生物污染的常见手段，目前杀菌剂主要包括甲醛缓释类、异噻唑啉酮类和酚类等[12-13]。以上杀菌剂尽管均是广谱性杀菌剂，但是每种杀菌剂均有针对性，例如甲醛缓释类杀菌剂抗细菌性优于抗真菌性，而酚类杀菌剂恰恰相反[14]。与此同时，灭杀不同类型微生物所需要的杀菌剂浓度也存在差异[15]。目前，国内鲜有针对水基金属加工液中微生物污染的研究，实际生产中往往依据经验向体系内添加杀菌剂。因此，分析金属加工液中的微生物种类对实际生产有着重要意义。

本文研究了从金属加工液中分离微生物的可行方法，在不降低微生物浓度的前提下实现微生物从金属加工液中的提取；
并借助Illumina MiSeq 高通量测序完成对6 组金属加工液样本的微生物群落组成分析，确定所有样品在门、纲、目、科、属和种6 水平下的类型组成，得出优势细菌和真菌，同时讨论了金属加工液组分对微生物生长的影响。本文有助于了解微生物对金属加工液使用寿命限制机理，且能指导杀菌剂的选择和添加。

1.1 样本采集和检测

实验共采集6 组来自于不同轧钢厂现场的金属加工液样本，且金属加工液配方不完全相同，但基本组成均为水、基础油和化学添加剂，其中水的质量分数超过90%，基础油为植物油、矿物油和动物油脂中的一种或多种，化学添加剂为油性剂、乳化剂和缓蚀剂等。样本的相关采集信息和属性指标见表1。每个样品采集3 份，将采集到的金属加工液储存于干净的聚乙烯瓶中冷冻保存运回实验室，实验期间所有样本均置于3～10 ℃低温环境下保存。样本的使用时间为采集前该金属加工液被连续使用的时长。

表1 样本采集信息Table1 Details of sample collection

使用pH 计(雷磁PHSJ-4 型)检测金属加工液样本中pH 值，同时利用重铬酸钾氧化法(国家标准HJ 828—2017)测定液相化学需氧量(COD)。

1.2 微生物分离方法及平板计数

破乳法：添加破乳剂是从油、水乳化体系中分离水相的常用手段[16]。实验选择聚合氯化铝(PAC)作为破乳剂，取20 mL 金属加工液样本于烧杯中，边搅拌边向烧杯中滴加0.5 g/L 的PAC 水溶液至出现明显絮体，随后用中速滤纸过滤，取清澈水相作为破乳法菌液。

离心法：取20 mL 金属加工液样本，多层纱布过滤去除杂质，然后置于离心管中，在4 000 r/min 下离心10 min[17]。移除液相部分，将底层固相转移至烧杯中，并使用已灭菌的磷酸盐缓冲液(pH=7.4) 冲洗以去除残留油分，重复离心、冲洗3 次，最后将固相分散在5 mL 缓冲液中，作为离心法菌液。

测菌片法：该系列实验使用德国舒美测菌片。将测菌片浸泡在金属加工液中10 s，随后置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。结束后，使用已灭菌磷酸盐缓冲液反复冲洗测菌片表面直至菌斑脱落，将得到的液相离心、定容至5 mL，作为测菌片法菌液。

细菌平板计数：使用稀释涂布平板法完成平板涂布，操作方法见文献[18]。培养温度为30 ℃，恒温培养48 h 后选取30～300 个菌落的平板计算细菌浓度，设置3 组平行实验，取平均值。培养平板采用LB(Luria-Bertani)培养基，具体组成如下：胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，氯化钠2 g，琼脂3.2 g，去离子水200 mL，pH 7.0～7.2[19]。

1.3 DNA 提取、PCR 扩增和Illumina MiSeq 测序

首先依据E.Z.N.A®soil 试剂盒(美国Omega Biotek 公司)说明书对制得的菌液进行DNA 抽提，并检测浓度、纯度和提取质量。PCR 扩增细菌通用引物序列为：806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 和338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，真菌通用引物为：ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA-3 ’) 和 ITS2R(5 ’-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3’)[20]。PCR 扩增结束后，使用2%(质量分数，下同) 琼脂糖凝胶回收产物，并纯化、洗脱。利用QuantiFluor™-ST(美国Promega 公司) 对回收产物检测定量。根据 Illumina MiSeq 平台(美国Illumina 公司)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建文库[21]。

1.4 序列处理与分析

原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，使用FLASH 软件进行拼接优化。使用的UPARSE 软件（Version 7.1）根据97% 的相似度对序列进行OTU(Operational Taxonomic Unit)聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP classifier 对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 数据库（SSU123），设置比对阈值为70%[20,22]。

2.1 微生物分离方法

微生物分离过程中体系中的油份会影响DNA抽提结果。因此，必须寻求一种合适的方式将微生物从金属加工液中分离出来，同时保证微生物浓度不降低。本文分别采用了破乳法、离心法和测菌片法3 种分离方式进行测试，并通过对分离得到的菌液进行细菌平板计数确定分离方式的可行性，实验结果见表2。

表2 分离前后不同样品细菌浓度Table2 Bacterial concentration of different samples before and after separation

结果表明，相比于原液，PAC 破乳得到的菌液中细菌浓度明显减少，说明在PAC 的静电吸引和架桥等作用下，水相中的微生物会被误去除。离心法保持了原有的细菌浓度，而测菌片法得到的菌液细菌浓度甚至超过原液，这是因为测菌片上存在微生物生长的营养源，实际上实现了对微生物的富集培养。

对离心法和测菌片法得到的菌液分别进行DNA抽提和PCR 扩增，结果表明离心法菌液扩增结果评级为C 级，表示PCR 产物目的条带太弱或未监测到，无法进行后续种群鉴定实验，推测原因可能是离心法菌液未完全去除残留油份，导致DNA 抽提不理想，进而限制PCR 扩增结果。与之相反，测菌片法菌液扩增评级为A 级，代表DNA 浓度高，可进行后续种群鉴定实验。因此，最终选定测菌片法来实现微生物从金属加工液中的分离。

2.2 微生物种类及多样性分析

借助Illumina MiSeq 高通量测序确定金属加工液中微生物多样性，分析结果见表3。送检的6 组金属加工液样品中均检测出细菌；
除QX2和JX 外，剩余4 组样本未检测出真菌。尽管检测出真菌的样本数少，但真菌拥有更丰富的种属组成。

表3 金属加工液微生物多样性统计Table3 Diversity of microbial in water-based metal working fluids

2.3 金属加工液细菌群落组成

首先在门、纲、目和科4 个水平对金属加工液细菌群落组成进行分析，测定结果见图1。从图中可以看出，这4 个水平下6 组金属加工液的群落组成清晰明了。其中，门组成仅由变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)构成；
在纲水平上只检测到变形菌纲(Gammaproteobacteria) 和杆菌纲(Bacilli)。相对丰度上，变形菌门(Proteobacteria) 和变形菌纲(Gammaproteobacteria)占据优势地位。同时，在目水平上，QX1、QX2、QX3和CJ 4 组金属加工液的优势细菌目保持一致，均为肠杆菌目(Enterobacterales)，而JX 和WF 的优势细菌目分别为伯克氏菌目(Burkholderiales)、芽孢杆菌目(Bacillales) 和假单胞杆菌目(Pseudomonadales)、乳杆菌目(Lactobacillales)。

图1 不同水平下金属加工液细菌群落组成Fig.1 Bacterial composition in metalworking fluid at different level

这种一致与差异并存的现象也在科水平上得以体现。QX1、QX2、QX3和CJ 4 组样本以肠杆菌科(Enterobacteriaceae)为主，而JX 和WF 样本分别以丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、芽孢杆菌科(Bacillales) 和假单胞杆菌科(Pseudomonadaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)作为优势细菌科。

在属水平下，各样本之间差异性测定结果见图2。6 组金属加工液共检测出10 种细菌属。QX1中柠檬酸杆菌属(Citrobacter) 相对丰度占比达到95%，是其优势细菌属。与此同时，柠檬酸杆菌属和Unclassified_f_Enterobacteriaceae属被发现同时存在于QX2、QX3和CJ 3 组样本中，区别在于QX2和CJ 中柠檬酸杆菌属(Citrobacter) 丰度超过50%，而QX3则是以Unclassified_f_Enterobacteriaceae属为主体。JX 样本的优势细菌属包括丛毛单胞菌属(Comamonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)。假单胞菌属(Pseudomonas)、气球菌属(Aerococcus)和克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)构成了WF 样本的优势细菌属。此外，也检测出了少量的不动杆菌属(Acinetobacter)、普罗威登斯菌属(Providencia)和摩根氏菌属 (Morganella)。

图2 属水平下金属加工液细菌群落组成Fig.2 Bacterial composition in metalworking fluid at genus level

种水平下细菌多样性分析见图3，共检测出14 种细菌，而各样本细菌种数与其COD 浓度呈正比，说明高有机物浓度的环境为细菌生长提供了更多能量来源。其中，QX1的优势细菌为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter_freundii_g_Citrobacter)，相对丰度占比为95.68%。柠檬酸杆菌属是金属加工液的易检出细菌[4]。除Citrobacter_freundii-g-citrobacter外，另一种柠檬酸杆菌Unclassified_g_Citrobacter在QX2、QX3和CJ 3 组样本中被发现也证实了这一点。但是金属加工液有机成分会对柠檬酸杆菌种类产生影响，例如Citrobacter_freundii具有以甘油为唯一碳源和能源的特性，而甘油可用作金属加工液的油性剂[23-24]。因此，这种特性可能导致拥有更多可利用营养源的Citrobacter_freundii能在QX1样本中占据主体地位。此外，QX2、QX3和CJ 3 组样本中均检测出一种肠杆菌Unclassified_f_Enterobacteriaceae，其存在可能与3 组金属加工液中添加没食子酸有关。没食子酸不仅是一种植物型缓蚀剂，同时还可被用于合成润滑油酯类基础油，然而没食子酸是Unclassified_f_Enterobacteriaceae生长起促进作用，造成该菌在QX2、QX3和CJ 3 组样本中被检测到[25-26]。JX 样本的优势细菌包括水丛毛单胞菌(Comamonas_aquatica)和炭疽芽胞杆菌(Bacillus_anthracis)，两者总丰度占比达到97.05%。其中，丛毛单胞菌也是金属加工液中的一种易检出细菌[15]。该菌适宜在中、碱性环境(pH=7～8)中生存，可利用环境中的有机氮作为营养源发生硝化作用，如金属加工液中使用的乳化剂三乙醇胺、胺型抗氧剂N,N’-二仲丁基对苯二胺等[27]。与此同时，炭疽芽胞杆菌(Bacillus_anthracis)作为一种由革兰氏阳性孢子形成的细菌，能够引发人畜共患急性传染病炭疽。由于孢子对干燥、消毒剂等常规灭杀手段具有很强的抵抗力，可通过金属加工液配制水源、空气等途径进入到加工体系中。炭疽芽胞杆菌繁殖体对周围环境抵抗力与一般细菌相似，所以要求JX 金属加工液样本在使用过程中必须配套灭菌措施，同时提升操作人员的安全防护等级。相比于其他样本，WF 优势细菌组成最为复杂，Unclassified_g_Pseudomonas(59.38%)、马尿气球菌(Aerococcus_urinaeequi) (18.98%)、Bioreactor_metagenome_g_Pseudomonas(9.34%)和Unclassified_g_Klebsie lla(8.97%)等4 种细菌相对丰度超过5%。其中相对丰度最高的细菌Unclassified_g_Pseudomonas隶属于假单胞菌属，也是一种金属加工液中易检出细菌属[15]。由于该类细菌具有以矿物油中烃类物质作为营养源的能力，所以导致其在有矿物油成分的WF 样本中具有更强生存能力，从而成为该样本下主体细菌[28]。然而，假单胞菌会将矿物油降解为其他细菌可利用的脂肪酸等中间体，所以WF 样本中出现了共存细菌种类多，但丰度占比均不高的情况。

图3 种水平下金属加工液细菌群落组成Fig.3 Bacterial composition in metalworking fluid at species level

值得注意的是，在发现的14 种细菌中，除炭疽芽胞杆菌(Bacillus_anthracis)、马尿气球菌(Aerococcus_urinaeequi)和贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus_velezensis)外(且这3 种细菌丰度占比有限)，其余11 种均为革兰氏阴性菌，说明金属加工液中检出细菌以革兰氏阴性菌为主。这主要是因为该6 组金属加工液主要用于铬、镍和铁等材料的加工过程，这些金属元素对革兰氏阴性菌的生长有促进作用[15]。

综上所述，检测出的14 种细菌均会缩短金属加工液的使用寿命。Citrobacter_freundii、Unclassified_f_Enterobacteriaceae、Comamonas_aquatica等细菌会分解金属加工液中油性剂、乳化剂等添加剂，从而破坏金属加工液的稳定性。与此同时，Unclassified_f_Enter obacteriaceae、Unclassified_g_Pseudomonas会破坏基础油结构，使其转化为有机酸等中间体物质并被Aerococcus_urinaeequi、Bacillus_anthracis等细菌作为营养源被进一步降解。

2.4 金属加工液真菌群落组成

6 组金属加工液中只有QX2和JX 两组样本检测出真菌，说明细菌比真菌更容易在金属加工液中被发现。这是因为真菌适宜的pH 为4.5～5.0，而金属加工液初始环境通常为中、碱性，所以真菌一般只出现在细菌污染严重的金属加工液中，此时由于细菌繁殖过程中产生了各类有机酸，导致金属加工液pH 明显下降[29-30]。因此，QX2和JX 两组样本具有6 组样本中最低的pH 值，且这两组金属加工液使用周期较长，会存在细菌污染浓度较高的情况，进而出现真菌繁殖现象。

门、纲、目、科4 个水平下的真菌组成如图4 所示。在门水平下，子囊菌门(Ascomycota)，担子菌门(Basidiomycota)，罗兹菌门(Rozellomycota) 和一种未知真菌(Unclassified_k_Fungi) 4 种真菌门被发现。随着种类划分精细度不断提高，真菌多样性逐步凸显，尤其是QX2样本，各水平下除未知真菌外其余真菌丰度差异小，种类多。而样本JX 分别以粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、赤壳菌科(Nectriaceae)作为纲、目和科3 个水平下的优势真菌。

图4 不同水平下金属加工液真菌群落组成Fig.4 Fungal composition in metalworking fluid at different level

属水平下金属加工液真菌组成如图5 所示，共有15 种真菌属被检测出。QX2样本的优势真菌属包括未知真菌属(Unclassified_k_Fungi)、罗兹菌属(Unclass ified_p_Rozellomycota)、Saitozyma属和Cutaneotrichosporon属，相对丰度均在5%以上。而样本JX 中只有镰刀菌属(Fusarium)和未知真菌属(Unclassified_k_Fungi)丰度超过5%。

图5 属水平下金属加工液真菌群落组成Fig.5 Fungal composition in metalworking fluid at genus level

种水平下真菌多样性分析见图6，两组金属加工液共携带了17 种真菌。尽管检出真菌样本数比检出细菌样本数少，但是后者有更多的种类。其中，QX2样本14 种，特有真菌(其他样本中未发现只在该样本中检测出的真菌种类)10 种；
JX 样本携带真菌7 种，特有真菌3 种。除未知真菌外，QX2和JX 样本共有真菌3 种，分别为Saitozyma_sp，Rozellomycota_sp和Unclassified_g_Talaromyces，这说明真菌的生存并不受限于金属加工液的原有成分。QX2样本中除未知真菌外，Saitozyma_sp相对丰度占比最高，接近10%，而样本JX 明显以Fusarium_petroliphilum为优势真菌。其中，Saitozyma_sp是一种酵母菌，Fusarium_petroliphilum是一种镰刀菌，当金属加工液浓度达到一定程度时，两种真菌的菌丝会导致管道、过滤系统堵塞，同时通过空气传播，威胁人体健康。

图6 种水平下金属加工液真菌群落组成Fig.6 Fungal composition in metalworking fluid at species level

微生物污染会缩短金属加工液使用寿命，威胁操作人员健康风险，因此，探索金属加工液中微生物多样性组成是十分必要的。实验首先探究了从金属加工液中分离微生物的可行方法，相较于破乳法和离心法，测菌片法能在提升微生物采集浓度的同时，保障后续DNA 抽提和PCR 扩增顺利进行，实现微生物从金属加工液中完美分离。

微生物多样性鉴定确定了6 组金属加工液中微生物的群落组成。细菌在所有样本中被检测出，而除QX2和JX 样本外，剩余样本未检测出真菌，证明细菌比真菌更容易污染金属加工液，真菌只存在于细菌污染严重的样本中。实验共检测出细菌2 门、2 纲、5 目、6 科、10 属 和14 种，而 真 菌 为4 门、8 纲、10 目、14 科、15 属和17 种，说明真菌具有更丰富的种属类别。

在种水平上，细菌中弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter_freundii)、Unclassified_g_Citrobacter、Unclassified_f_Enterobacteriaceae、水丛毛单胞菌属(Comamonas_aquatica)和Unclassified_g_Pseudomonas相对丰度占比较高，作为优势细菌存在于不同样本中，且WF 样本携带细菌种类最多，检测出的细菌以革兰氏阴性菌为主。金属加工液有机组分会影响细菌类别，所有细菌通过不同途径破坏金属加工液的稳定性，缩短其使用寿命。QX2样本具有最多的真菌种类，但在种水平，除未知真菌外，其他真菌丰度接近，而JX 样本以Fusarium_petroliphilum为优势真菌。

猜你喜欢金属加工菌液群落金属加工杂志社金属加工(冷加工)(2023年2期)2023-02-23《金属加工（热加工）》2023年第1期广告目次金属加工(热加工)(2023年1期)2023-02-02《金属加工(冷加工)》2022年第10期广告目次金属加工(冷加工)(2022年10期)2022-10-27大学生牙龈炎龈上菌斑的微生物群落昆明医科大学学报(2022年2期)2022-03-29多糖微生物菌液对油菜吸收养分和土壤氮磷淋失的影响中国土壤与肥料(2021年5期)2021-12-02合成微生物群落在发酵食品中的应用研究食品安全导刊(2021年20期)2021-08-30金属加工杂志社金属加工(冷加工)(2020年12期)2021-01-11Bonfire Night疯狂英语·新悦读(2020年7期)2020-07-30我国西北某陆地油田采出水微生物群落结构河南科学(2020年3期)2020-06-02鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验中通过吸光度值测定菌液浓度的方法研究癌变·畸变·突变(2020年1期)2020-02-12 相关热词搜索：多样性，微生物，加工，