HPLC-ELSD,和UPLC-MS/MS,法考察复方金银花颗粒中金银花投料规范性
时间：2023-04-22 12:50:05 来源：千叶帆 本文已影响人
王舒，姚奕然，黄赛燕，刘欢欢，徐丹洋，周谧
南通市食品药品监督检验中心，江苏 南通 226006
复方金银花颗粒具有清热解毒，凉血消肿的功效，用来治疗风热感冒，喉痹，乳蛾，目痛，牙痛及痈肿疮疖等病症。该制剂是治疗风热感冒的常用药。复方金银花颗粒由金银花、连翘、黄芩三味中药组成。其中金银花的植物来源经历了多次变更，《中国药典》2005 年版将金银花和山银花分列，规范了金银花的来源，只收载了忍冬科植物忍冬一种来源；
而收载的山银花，来源为灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬和黄褐毛忍冬［1］。
金银花和山银花为近缘植物，药材的形态特征相似，但仍存在细微差别。相关文献报道金银花和山银花主要在化学成分、药理研究方面存在差异。金银花的体外抑菌效果优于山银花，高剂量山银花提取物能够引起大鼠的超敏反应［2］。在中药注射剂的应用中，相比于金银花，山银花在发生溶血方面存在较大的隐患［3］。目前，《中国药典》2020 年版中诸多含金银花药材的制剂对山银花都进行检查，标准中规定不可检出山银花的主要成分灰毡毛忍冬皂苷乙。但由于金银花药材价格持续高涨，为降低生产成本，获取更高的利润，市场上存在着以山银花掺入金银花药材进行销售的现象，部分厂家生产的金银花制剂可能存在采用掺有山银花的掺伪金银花投料［4-9］。复方金银花颗粒现行的法定标准中没有相应的检验项目，无法有效地控制金银花投料的规范性。
复方金银花颗粒处方为使用金银花投料，通过国家药典委员会信息的查询，无复方金银花颗粒生产企业对处方提出变更，且标准中均未涉及对山银花的检查，对于生产中投入掺杂山银花的行为未能起到有效的监督。为提高复方金银花颗粒的质量控制水平，为药品安全监管提供强有力的技术支撑，本研究拟对市售复方金银花颗粒的金银花投料情况进行考察，结合金银花和山银花所含主要成分的特点［10-12］，参考《中国药典》2020 年版一部中银黄颗粒［13］及国家药品监督管理局发布的药品补充检验方法银柴颗粒、小儿咽扁颗粒、清热解毒口服液的山银花检查项，以灰毡毛忍冬皂苷乙作为山银花的特征组分，采用高效液相-蒸发光散射（HPLCELSD）法建立复方金银花颗粒中掺杂山银花的检查方法，并建立超高效液相-质谱联用（UPLC-MS/MS）法，对HPLC-ELSD 法检测阳性的样品进行确证，以评价该制剂中金银花的投料规范性。
Dionex U3000 高效液相色谱仪配Thermo A2D蒸发光散射检测器、U3000 Vanquish-ALTIS 超高效液相色谱/质谱联用仪（美国ThermoFisher 公司）；
CPA225D 电子天平（德国Sartorius 公司）；
KQ-250E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
Milli-Q Element 型超纯水机（美国密理博公司）。
对照品：灰毡毛忍冬皂苷乙（纯度：97.2%，批号：111814-202005），川续断皂苷乙（纯度：96.8%，批号：111813-201804）均购于中国食品药品检定研究院；
实验所用的复方金银花颗粒样品为在市场流通环节抽样获得，不同生产厂家共30 批次样品，乙腈（德国默克，色谱纯），其余试剂均为分析纯。
2.1 HPLC-ELSD 法
2.1.1 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相：乙腈（A）-0.4%乙酸溶液（B）；
梯度洗脱程序：0～15 min，5% →20% A；
15～30 min，20% →30% A；
30～40 min，30% A；
流速：1.0 mL/min；
柱温：30 ℃；
进样量：20 μL；
蒸发光散射检测器条件：漂移管温度105 ℃，空气流速：3.0 L/min。
2.1.2 供试品溶液取复方金银花颗粒阳性样品（检出灰毡毛忍冬皂苷乙的样品，以下简称阳性样品）（规格：每袋装10 g，批号：531908）5 袋的内容物，研细，混匀，取粉末5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理20 min（功率300 W，频率50 kHz），取出放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.3 对照品溶液取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品10 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，用50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2.1.4 阴性样品溶液取金银花药材（经鉴别为正品）、连翘药材、黄芩药材，按复方金银花颗粒处方的制备方法进行模拟工艺实验，制备阴性样品。阴性样品照“2.1.2”项下方法制备，制成阴性样品溶液。
2.1.5 线性关系考察分别精密量取“2.1.3”项下的对照品溶液适量，用50%甲醇稀释成每1 mL 约含灰毡毛忍冬皂苷乙20、50、100、200 和800 μg 的系列对照品溶液，照“2.1.1”项下的方法条件依次进样，测定峰面积A，以系列对照品溶液进样量（μg）的对数值为横坐标（Log C），相对应的峰面积对数值为纵坐标（Log A），绘制标准曲线，计算灰毡毛忍冬皂苷乙的回归方程：Log A=1.594 2 Log C-2.258 3，r=0.999 3。结果表明，灰毡毛忍冬皂苷乙在0.39～15.74 μg 的范围内，线性关系良好。
2.1.6 精密度试验取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液（浓度：49.183 2 μg/mL），照“2.1.1”项下的方法条件依次进样20 μL，连续重复进样6 次，以对照品峰面积A 为考察指标，计算RSD 值为0.80%（n=6），表明仪器的精密度良好。
2.1.7 重复性试验取复方金银花颗粒阳性样品（批号：531908），照“2.1.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，照“2.1.1”项下的方法条件分别进样测定，记录峰面积，根据“2.1.5”项下的相应回归方程计算，平均含量为1.10 mg/g，RSD 为0.68%（n=6），表明方法的重复性良好。
2.1.8 回收率试验取复方金银花颗粒阳性样品（批号：531908）的粉末9 份，每份5 g，精密称定，分别置25 mL 量瓶中（共3 组，每组3 份），分别向每组精密加入浓度为1.960 3 mg/mL 的灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液2.0、3.0 和4.0 mL，照“2.1.2”中的方法平行制备9 份供试品溶液，照“2.1.1”项下的方法条件分别进样测定，记录峰面积，根据“2.1.5”项下的相应回归方程计算回收率，结果表明平均回收率为97.35%，RSD 为2.26%，结果见表1。
表1 回收率试验考察结果（n=9）
2.1.9 稳定性试验在0、2、4、8、12、24 h 分别取同一份对照品溶液、同一份供试品溶液，照“2.1.1”项下的方法条件进样测定，分别记录两种溶液中灰毡毛忍冬皂苷乙峰面积，RSD 分别为1.34%和1.16%（n=6），表明对照品溶液、供试品溶液中主成分灰毡毛忍冬皂苷乙稳定性良好。
2.1.10 专属性试验将对照品溶液、依照处方自制样品溶液（含5%山银花）、供试品溶液（含灰毡毛忍冬皂苷乙的阳性样品，批号：531908）、阴性样品溶液（不含山银花）和空白溶剂（50%甲醇），照“2.1.1”项下的方法条件测定，结果表明：采用灰毡毛忍冬皂苷乙作为区分金银花和山银花的特征组分是可行的；
自制样品和阳性样品中均呈现与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液保留时间一致的色谱峰，而阴性样品中无相对应的色谱峰，表明其他组分无干扰，方法专属性良好。见图1。
图1 专属性试验的高效液相色谱图
2.1.11 限度溶液取处方中金银花用量按掺入1%、3%和5%山银花投料，其余药味按本品处方比例投料，按照工艺制法制成含不同比例山银花的自制样品，照“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制成含不同比例山银花供试品溶液。
精密量取“2.1.3”项下的对照品溶液2 mL，置100 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得灰毡毛忍冬皂苷乙的限度溶液（定量限溶液：20 μg/mL）。
将上述溶液照“2.1.1”项下的方法条件测定，结果表明：掺入1%山银花的供试品溶液中检出灰毡毛忍冬皂苷乙（低于定量限）；
掺有3%和5%山银花的供试品溶液中均检出灰毡毛忍冬皂苷乙；
当掺入3%山银花时，所测得的峰面积与定量限相当（S/N 约为10）。
2.1.12 判定原则供试品色谱中，在与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品色谱峰保留时间相应的位置不得出现相同的色谱峰。若出现保留时间相同的色谱峰，且该色谱峰的峰面积值大于限度溶液（20 μg/mL）的峰面积值，则视为阳性检出。
2.1.13 样品测定取不同产地、不同厂家生产的共30 批金银花颗粒样品，照“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液，照“2.1.1”项下的方法条件测定，依据“2.1.11”项下的判定原则判定，其中有15 批样品检出灰毡毛忍冬皂苷乙（峰面积大于限度溶液的峰面积值），判定为阳性检出。结果见表2。
表2 样品中灰毡毛忍冬皂苷乙的测定结果
2.2 UPLC-MS/MS 法
2.2.1 UPLC-MS/MS 法色谱条件色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18 柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；
流动相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；
梯度洗脱程序：0～1 min，90% A；
1～7 min，90%→55% A；
7～9 min，55%→5% A；
9～10 min，5% A；
10～12 min，5%→90%A；
12～17 min，90% A；
流速：0.2 mL/min；
柱温：30 ℃；
进样量：2 μL。采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM），离子化电压：4 000 V；
鞘气：35 Arb；
辅助气：10 Arb；
离子传输管温度：350 ℃；
蒸发温度：300 ℃；
选择离子对（H+）：m/z1 399.8 →633.2 和m/z1 399.8 →795.2 作为灰毡毛忍冬皂苷乙的检测离子对。
2.2.2 溶液的制备精密量取“2.1.3”项下的对照品溶液适量，用50%甲醇稀释成1.0 μg/mL 的溶液，作为对照品溶液。精密量取HPLC-ELSD 法检查呈阳性的供试品溶液，用50%甲醇稀释为与对照品溶液浓度一致的溶液,作为供试品溶液。
2.2.3 样品的测定精密吸取“2.2.2”项下的溶液和“2.1.4”项下的阴性样品溶液，照“2.2.1”项下的质谱条件测定，结果表明：经UPLC-MS/MS 法验证，HPLC-ELSD 法筛查出的15 批次呈阳性的样品溶液提取离子流色谱图中，均呈现与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液色谱相对应的质谱峰；
而阴性样品溶液的提取离子流色谱图中，未呈现相对应的质谱峰。由此可见，建立的HPLC-ELSD 法可准确检出灰毡毛忍冬皂苷乙，且与UPLC-MS/MS 法的验证结果一致。见图2。
图2 UPLC-MS/MS质谱图：A.对照品溶液；
B.阳性样品溶液；
C.阴性样品溶液
3.1 特征组分的选择
《中国药典》2020 年版一部山银花药材的含量测定项下，以川续断皂苷乙及灰毡毛忍冬皂苷乙作为山银花的特征成分［13］。在建立本方法的研究过程中，考察过川续断皂苷乙特征成分在复方金银花颗粒中的检测情况。本次检出阳性的15 批次样品中，只有7 批次检出川续断皂苷乙。另参考已发布的金银花制剂银柴颗粒、小儿咽扁颗粒、清热解毒口服液等的山银花检查项补充检验方法，均选用灰毡毛忍冬皂苷乙作为山银花的特征成分。基于上述原因，本方法亦选灰毡毛忍冬皂苷乙作为检测指标成分。
3.2 样品提取溶剂和提取时间的选择
试验过程中共考察了4 种溶剂：纯化水、50%甲醇、70%甲醇和甲醇，分别超声处理（功率300 W，频率50 kHz）不同的时间（20 min、30 min 和45 min），结果表明：选择50%甲醇为提取溶剂，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）20 min，灰毡毛忍冬皂苷乙的提取效率最优。
3.3 限度溶液浓度的制定
考虑到不同品牌的设备灵敏度存在差异，当样品中的灰毡毛忍冬皂苷乙成分处于微量水平时，容易出现不同的判定结果。为避免上述情况的发生，本方法设定一定浓度的限度溶液，使用于检测的仪器必须能够检出限度溶液。综合考虑“2.1.11”项下液相验证的结果，掺入3%比例的山银花的样品与定量限（20 μg/mL）较为接近，故将方法的限度溶液浓度定为20 μg/mL，样品的检测结果统一与限度溶液进行比对，从而保证检测判定尺度一致。
3.4 制剂投料规范性评价
本实验研究建立的HPLC-ELSD 法和UPLCMS/MS 法都能够准确检测出复方金银花颗粒中的灰毡毛忍冬皂苷乙，有良好的兼容性，均可用于鉴别复方金银花颗粒中山银花替代金银花投料。此外，HPLC-ELSD 法具有成本低、操作简单等优点，而UPLC-MS/MS 法具有时间短、灵敏度更高的优点。因此，对复方金银花颗粒中山银花替代金银花的鉴别，可先用HPLC-ELSD 法进行检测，再进一步采用UPLC-MS/MS 法进行确证，避免假阳性的出现，弥补现行质量标准对金银花投料规范性监测的盲点。
本次研究针对不同生产企业共30 批次的复方金银花颗粒，按建立的HPLC-ELSD 法和UPLC-MS/MS法进行检验，15 批次样品检测出灰毡毛忍冬皂苷乙特征组分，不合格率为50%。结果表明，市售的该制剂品种中存在用掺有山银花的掺伪金银花进行投料生产的现象。因此，有必要在现行标准中增加山银花检查项，建立一种简便、准确、高效的方法测定山银花专属成分灰毡毛忍冬皂苷乙，加强对复方金银花颗粒的有效监督，以提高其质量水平。
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