放养密度对IPRA养殖太湖鲂鲌生长、抗氧化酶及肠道微生物群落的影响

李 倩 孙丽慧 姜建湖 陈建明 郭建林 高令梅 张海琪

(农业部淡水渔业健康养殖重点实验室, 浙江省淡水水产研究所, 湖州 313000)

池塘内循环流水养殖(In-pond Raceway aquaculture, IPRA)于20世纪90年代由美国奥本大学开发[1], 于2013年引进我国, 已在我国较多地区得到推广。该系统通过现代土建工程对池塘进行改造, 利用占池塘面积5%左右的水面作为养殖区, 其余95%的水面作为净化区, 实现池塘高密度养殖和水体循环利用。和传统养殖模式相比, IPRA具有水体利用率高、产量高、管理方便等优点[2]。截至2019年, 全国已建成IPRA养殖系统2000条以上, 浙江省于2015年引进该模式并进行示范推广, 全省跑道保有量超900条, 总体规模位居全国第二[3,4]。目前, 已有较多学者报道了有关IPRA在养殖模式、水环境变化、品质影响[5—8]等方面的研究。

养殖密度是影响集约化养殖产量、收益和生态效益的重要因素, 养殖密度过低会降低资源利用率也不利于鱼类群体行为的形成[9]。养殖密度过高会影响养殖对象的生长、造成应激反应, 增大养殖风险[10]。目前, 已有研究报道了IPRA养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)[3]、罗非鱼(Oreochromis niloticus)[11]、团头鲂(Megalobrama amblycephala)[12]和草鱼(Ctenopharyngodon idella)[13]等品种的适宜密度。太湖鲂鲌以翘嘴鲌为母本、三角鲂为父本,经群体选育和异源雌核发育技术, 通过远缘杂交获得的国家水产新品种(GS-02-001-2017), 具有食性杂、饲料转化率高、肌间刺少等优点[14], 适合池塘内循环流水养殖。目前, 有关太湖鲂鲌的研究主要涉及肠道微生物、基因克隆、肌肉品质和饲料营养等方面[15—18], 但有关IPRA系统养殖太湖鲂鲌的最佳密度尚有待于确定。本研究以太湖鲂鲌幼鱼为研究对象, 探讨了放养密度对太湖鲂鲌生长、抗氧化酶和肠道微生物群落的影响, 旨在进一步探讨IPRA养殖模式下太湖鲂鲌的合理放养密度, 为太湖鲂鲌IPRA养殖提供参考。

1.1 试验材料

试验鱼为本所自行繁育的太湖鲂鲌冬片鱼种,平均初始体重为(5.58±0.45) g。试验跑道位于浙江省淡水水产研究所八里店综合试验基地, 长22 m,宽5 m, 高 2.0 m, 实际水深1.7 m。试验设置3个放养密度, SD1组放养密度为0.5 kg/m3, SD2组放养密度为1.0 kg/m3, SD3组放养密度为1.5 kg/m3。每天早晚各投饲1次, 投饲量为鱼体质量的2%—5%, 放养时间为2019年4月17日, 试验期180d。

1.2 方法

生长性能测定分别于养殖第90、第120、第150和第180天, 每个密度组随机选取30尾鱼, 测量其体重、体长, 解剖后取内脏和肝脏, 称重, 计算各组太湖鲂鲌的特定生长率(SGR)、肥满度(CF)、肝体比(HSI)、脏体比(VSI)和成活率(SR)。各指标按下式计算:

式中,W1和W2分别为时间t1与t2时的体重(g);W肝脏表示肝脏重(g);W内脏表示内脏重(g);L表示体长(cm);N0表示初始鱼尾数,Nt为养殖t时间时成活的尾数。

血清酶活测定各实验组随机选取3尾鱼,MS-222麻醉后尾静脉采血, 在4℃, 2500 r/min 离心20min制备血清, 保存于-80℃冰箱中备用。分别测定血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)和酚氧化酶(PO)活力。

肝脏组织酶活测定各实验组随机选取3尾鱼, 解剖后取肝脏, 用预冷的0.9%生理盐水快速冲洗, 准确称取肝脏组织, 按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水, 在冰浴条件下机械匀浆, 在 4℃下2500 r/min低温离心15min, 取上清液, -80℃冰箱保存备用。检测指标为T-SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA),以上试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

肠道微生物群落组成分析在试验结束后,每个密度组随机挑选太湖鲂鲌5尾, 解剖后取全肠,剔除肠道表面的脂肪组织, 灭菌去离子水冲洗, 用无菌剪刀剪开肠道, 然后用灭菌的解剖刀轻刮肠道内溶物, 样本混合后保存在无菌离心管, -80℃保存,每个实验组3个重复。细菌总DNA的提取参照Bacterial DNA Kit试剂盒(Omega, 美国)的说明步骤。16S rRNA基因测序以V3和V4区为目标设计引物,引物序列为338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′)。PCR采用TransGen AP221-02, 反应体系20 μL: 5×FastPfu缓冲液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、5 μmol/L上下游引物各0.8 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、BSA 0.2 μL、DNA模板10 ng, 补双蒸水至20 μL。PCR反应条件: 95℃ 3min; 95℃ 30s,55℃ 30s, 72℃ 45s, 27个循环; 72℃延伸10min。PCR反应在PCR反应仪9700 (Applied Biosystems®GeneAmp®, CA, 美国)上进行。PCR产物经Beads纯化后委托上海美吉生物医药科技有限公司(上海,中国)进行高通量测序。

1.3 数据分析

采用SPSS16.0统计软件进行差异显著性分析,利用方差分析(ANOVA)中Duncan多重比较检验显著性, 当P＜0.05时差异显著。

2.1 放养密度对太湖鲂鲌生长的影响

不同放养密度组太湖鲂鲌的生长参数见表 1。在养殖120d前, SD1和SD2组太湖鲂鲌的体重显著大于SD3组(P＜0.05), SD1和SD2组之间无显著差异(P＞0.05)。养殖150—180d, 太湖鲂鲌的体重随着养殖密度的增加显著降低(P＜0.05)。不同放养密度组太湖鲂鲌的CF、HSI和VSI在养殖120d前无显著差异(P＞0.05)。养殖150—180d, SD2和SD3组的CF和VSI显著低于SD1组(P＜0.05), 而SD2和SD3组之间无显著差异(P＞0.05)。养殖150d前无发病和死亡现象, 太湖鲂鲌的存活率均为100%, 养殖后期存活率随着放养密度增加有所降低。

表1 不同放养密度组太湖鲂鲌的生长参数(平均值±标准误, n=30)Tab. 1 Growth parameters of hybrid strain at different stocking densities (mean±SE, n=30)

如图 1所示, 养殖90—120d, SD1和SD2组SGR显著大于SD3组(P＜0.05), SD1和SD2组之间无显著差异(P＞0.05)。养殖150—180d, 各实验组的SGR随着放养密度的增加显著降低, 即SD3＜SD2＜SD1(P＜0.05)。

图1 各密度组太湖鲂鲌SGR曲线Fig. 1 The SGR curve of hybrid strain of different stocking densities

2.2 放养密度对太湖鲂鲌血清抗氧化酶的影响

如表 2所示, 养殖90d时, 血清中各抗氧化酶的活力随着放养密度的增加而升高, SD3组显著高于SD1组(P＜0.05)。养殖120d, SD2和SD3组抗氧化酶的活力无显著差异(P＞0.05)。养殖150—180d,血清中各抗氧化酶的活力随着放养密度的增加有所降低, SD3组抗氧化酶的活力显著低于SD1组(P＜0.05)。

表2 各实验组太湖鲂鲌血清抗氧化酶活力(平均值±标准误,n=3)Tab. 2 Antioxidant enzyme activities in serum of hybrid strain at different stocking densities (mean±SE, n=3)

2.3 放养密度对太湖鲂鲌肝脏抗氧化酶的影响

如表 3所示, 养殖90d, 不同密度组肝脏中TSOD和CAT的活力无显著差异(P＞0.05), 养殖120d,随着放养密度的增加, 肝脏中抗氧化酶的活力有所升高, SD2和SD3组显著高于SD1组(P＜0.05)。养殖150—180d, 肝脏中抗氧化酶的活力随着放养密度的增加有所上升, 其中GSH-Px的活力随着放养密度的增加显著升高(P＜0.05)。在养殖前120d, 丙二醛(MDA)水平随着放养密度的升高有所降低, 养殖150d, MDA水平随着放养密度的升高有所上升,各组间无显著差异(P＞0.05)。养殖180d, SD2和SD3组的MDA含量显著高于SD1组(P＜0.05)。

表3 各实验组太湖鲂鲌肝脏抗氧化酶活力(平均值±标准误,n=3)Tab. 3 Antioxidant enzyme activities in liver of hybrid strain at different stocking densities (mean±SE, n=3)

2.4 放养密度对太湖鲂鲌肠道微生物群落的影响

在门水平, 各密度组太湖鲂鲌肠道微生物的优势菌相同, 主要包含变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和厚壁菌(Firmicutes), 其中, SD3组变形菌门的丰度比SD1和SD2组增加了33.27%(图 2)。各密度组在属水平的物种组成见图 3, SD1和SD2组优势菌相同, 分别为norank_c_Cyanobacteria、分枝杆菌(Mycobacterium)、norank_f_Hados_Sed.Eubac.3, norank_o_PeM15。SD3组的优势菌发生改变, 以为气单胞菌(Aeromonas)、假单胞菌(Pseudomonas)和分枝杆菌(Mycobacterium)属为主要优势菌。对属水平的物种组成差异性进行分析(图 4), 微鞘藻属(Microcoleus)、鲸杆菌属(Cetobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)的相对丰度在SD3组显著高于SD1和SD2组(P＜0.05)。

图2 各实验组在门分类水平的细菌微生物群落组成Fig. 2 The bacterial communities in all of the samples on phylum level

图3 各实验组在属分类水平的细菌微生物群落组成Fig. 3 The bacterial communities in all of the samples on genus level

图4 各组在属水平的差异比较Fig. 4 Comparison between different groups in the level of genus

如表 4所示, Shannon 指数可以反映群落的多样性, 其值越大, 群落多样性越高, Simpson 指数相反。本试验结果表明, 随着放养密度的增加, 各密度组的Shannon 多样性指数显著降低(P＜0.05),Simpson 指数显著升高(P＜0.05)。所有样品的覆盖率均达到99%以上, 表明样本中的所有微生物都被检测到, 可以代表样本的真实情况。

表4 肠道微生物样本的多样性指数(平均值±标准误, n=3)Tab. 4 Alpha-diversity indexes of gut microbiota in all of samples(mean±SE, n=3)

3.1 放养密度对太湖鲂鲌生长性能的影响

本研究结果表明, 养殖初期, 放养密度未对太湖鲂鲌的肥满度、肝体指数和脏体指数产生显著影响, 这是因为养殖初期鱼体较小, 太湖鲂鲌对空间、食物的竞争较小, 养殖环境差异不大, 密度胁迫效应尚未对太湖鲂鲌形体指标产生显著影响。有学者研究了放养密度对跑道养殖大口黑鲈生长的影响[19], 结果表明, 养殖30d时, 中密度组(0.4 kg/m3)的体重和特定生长率显著高于低密度组和高密度组。当养殖时间为90—120d, 低密度组(0.2 kg/m3)生长最快, 增加养殖密度会显著降低大口黑鲈的生长, 这一结果和本研究结果相同。已有研究表明, 不同鱼类的养殖密度都有一个阈值, 当超出阈值后, 随着放养密度的增加, 鱼类的摄食量、饲料转化率会随着密度的增加显著降低, 鱼体对水体空间、溶解氧、食物竞争增大, 抑制其生长[20-23]。本研究结果提示, 当养殖时间为120d, 太湖鲂鲌幼鱼的放养密度为0.5—1.0 kg/m3时, 增加放养密度会提高太湖鲂鲌幼鱼的生长, 当放养密度达到SD3设定值时, 太湖鲂鲌的SGR和体重随着放养密度的增加显著下降, 根据体重推算, SD2组对应的养殖密度为13.82 kg/m3, 因此, 养殖时间为120d时, 建议太湖鲂鲌的养殖密度阈值为13.82 kg/m3。当养殖时间超过150d, SD1组对应的养殖密度为22.14 kg/m3, 增加放养密度会显著降低太湖鲂鲌的特定生长率和体重, 而且当养殖至180d, 各密度组太湖鲂鲌的存活率有所降低, 因此, 当养殖时间超过150d, 建议太湖鲂鲌的养殖密度阈值为22.14 kg/m3。

3.2 放养密度对太湖鲂鲌血清抗氧化酶的影响

鱼类的血液生化指标是反应鱼体健康状况的一类重要指标, 当外界环境变化时, 其血液生化指标会随之改变[24,25]。SOD是清除体内氧自由基的重要抗氧化酶, 可将鱼体内超氧自由基转化为H2O2和O2, 而CAT可以将H2O2分解成无毒的H2O和O2[26,27]。养殖初期T-SOD和CAT水平的升高可能是为了保护机体免遭H2O2的伤害。T-AOC作为抗氧化能力的重要酶活, 可以反映机体的抗氧化能力。本试验中各密度组的T-AOC活力呈现先升高后降低的趋势, 这可能和养殖后期太湖鲂鲌已经逐渐适应养殖环境有关, 也可能和太湖鲂鲌的抗氧化能力受到抑制有关。当养殖对象受到胁迫时, 细胞中的酚氧化酶原(proPO)可以转化为酚氧化酶(PO)从而发挥免疫功能[28]。在养殖120d前, 高密度组PO活力的升高可能是太湖鲂鲌应对高密度胁迫的结果。但在养殖后期, PO活力随着放养密度的增加而显著降低, 这可能是因为受放养密度的胁迫,太湖鲂鲌的机体免疫系统受到抑制, 导致PO的活力显著降低。

3.3 放养密度对太湖鲂鲌肝脏抗氧化酶的影响

肝脏是鱼类重要的新陈代谢器官, 参与鱼体中抗氧化、糖原合成等重要的生理过程, 已有较多研究报道了环境因子对鱼类肝脏酶活的影响[29-31]。除SOD和CAT外, GSH-PX也可以通过催化GSH的氧化偶联而去除H2O2, 可以保护细胞免受损伤[32]。本试验结果表明, 在养殖初期, 太湖鲂鲌肝脏中TSOD和CAT活力在各组间无显著差异, 这可能是因为养殖初期鱼体较小, 放养密度尚未对环境和鱼体肝脏造成显著负荷。在养殖120d后, 太湖鲂鲌肝脏中抗氧化酶的活力随着放养密度的增加而升高, 尤其在养殖中后期, SD3组肝脏中抗氧化酶的活力显著高于SD1组, 说明随着养殖时间的延长, 受放养密度胁迫, 鱼体代谢加快, 太湖鲂鲌利用肝脏中抗氧化酶活性升高以清除产生的大量活性氧, 以适应密度胁迫带来的应激状态。

MDA是生物体内脂质过氧化物的终产物, 毒性积累过高会引起细胞损伤。养殖前120d, 太湖鲂鲌肝脏中MDA的含量随着放养密度的升高而降低,说明在养殖中前期, 肝脏中抗氧化酶的水平可以清除随着放养密度的升高而引发的脂质过氧化物, 导致MDA含量降低。但在养殖后期, MDA含量随着放养密度的升高而增加, 且在养殖180d时, SD3组和SD2组的MDA水平显著高于SD1组。这表明随着太湖鲂鲌幼鱼的生长, 密度和环境胁迫逐渐显现,虽然太湖鲂鲌肝脏中的抗氧化酶水平有所升高, 但已不足以清除过多的脂质过氧化物, 导致其肝脏中MDA水平积累, 这和颌鲂幼鱼的研究结果相似[33]。因此, 在养殖后期, 要注意高密度组太湖鲂鲌肝脏细胞中MDA积累过高引起的细胞损伤。

3.4 放养密度对太湖鲂鲌肠道微生物群落的影响

肠道微生物是肠道的重要组成部分, 在养殖对象的发育、消化、机体代谢方面发挥重要作用[34,35]。有报道表明, 变形菌门中的许多物种被认为是水产动物的有害菌, 变形菌门的增加是疾病的潜在诊断标志[36]。本研究结果表明, SD3组变形菌门的丰度显著增加, 且来自变形菌门的不动杆菌属、气单胞菌属及假单胞菌属在高密度组显著增加, 这和团头鲂[37]的研究结果一致。不动杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属等是常见的病原菌, 虽然在本试验条件下未出现鱼体发病情况, 但病原菌数量增加可能会影响肠道健康、增加患病风险。随着放养密度的增加, SD3组肠道菌群多样性显著降低, 这一结果和课题组前期的研究结果一致[15]。微生物群落多样性是维持群落稳定的重要因素, 肠道微生态系统的平衡对于水产动物肠道健康的维持十分关键[38]。在本研究中, SD3组太湖鲂鲌肠道微生物群落多样性显著降低, 且气单胞菌属、假单胞菌属及弧菌属等病原菌属显著增加, 表明受养殖密度胁迫,高密度养殖组微生物群落结构发生显著变化, 群落多样性显著降低, 群落均一性较差, 而微生物群落失衡对鱼体会产生不利的影响, 因此, 要注意高密度养殖模式下太湖鲂鲌的肠道健康。

综上所述, 当养殖时间小于120d时, SD1和SD2组太湖鲂鲌的生长性能、抗氧化酶等无显著差异, 建议IPRA模式下太湖鲂鲌幼鱼的放养密度以1.0 kg/m3为宜; 当养殖时间为150—180d时, 太湖鲂鲌的体重和SGR随着放养密度的增加显著降低,建议放养密度不超过0.5 kg/m3。肠道微生物群落分析结果表明, 随着放养密度的增加, 太湖鲂鲌肠道微生物群落组成发生改变, 多样性显著降低, 养殖后期, 应注意高密度养殖组太湖鲂鲌的肠道健康。

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