采用通用引物PCR技术检测不同类型人乳头瘤病毒的研究
时间：2020-04-29 05:18:10 来源：千叶帆 本文已影响人
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【摘 要】人乳头瘤病毒（human papillomavirus， HPV）在人群中感染率较高，并且宫颈癌等多种肿瘤的发生密切相关，但目前仍缺乏一种简单快捷的检测方法。本研究选取中国境内常见高毒力HPV病毒，根据其相对保守序列设计通用引物GP5和GP6，采用PCR法检测各种HPV。研究结果表明，通用引物GP5和GP6可以检出HPV-16、18、11、6、52型，但HPV-58、51、31和33型未能检出。本研究建立的通用引物GP5和GP6已基本涵盖我国境内高毒力型HPV，具有极高的临床应用价值。
【关键词】人乳头瘤病毒;通用引物;PCR
【中图分类号】R730 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2018）08-0118-01
人乳头瘤病毒（human papillomavirus， HPV）與许多常见病有关，该病毒的研究在人群传播广泛。大量研究发现，宫颈癌以及其他肿瘤（包括胃癌、肺癌和食道癌等）均与HPV的感染直接相关[1]。由于HPV种类繁多，目前确认的种类已达到60余种，其中可以感染人的有6型、11型、16型、18型和33型等十余种型别[2]。
核酸杂交技术和聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction， PCR）是目前检测HPV的主要方法，但由于HPV型别复杂，现有的PCR-反向点杂交法检测成本高昂，难以在临床大规格推广。我们借鉴国外报道，使用通用引物检测HPV感染，取得了较好的效果，现将结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 标本
6份不同类型HPV标本，采集自本院宫颈糜烂患者宫颈脱落细胞，采用亚能生物技术公司HPV分型检测试剂盒检测并确定HPV型别。选取携带HPV-11、16、18、31、33、51、52和58型样本用于本研究。
1.2 试剂和仪器
HPV分型检测试剂盒购自亚能生物技术（深圳）有限公司;分子杂交仪（YH-H16）购自深圳亚能生物技术有限公司;2×PCR Master Mix预混液购自南京诺唯赞公司;DNA Marker 2000 bp购自上海捷瑞公司;PCR扩增仪和凝胶电泳成像分析系统均购自美国Bio-Rad公司;水平电泳套件购自上海天能生物公司。
1.3 通用引物合成
根据HPV基因组高度保守L1序列设计通用引物，其序列为：HPV-GP5： TTTGTTACTGTGGTAGATAC和HPV-GP6： GAAAAATAAACTGTAAA TCA。其PCR产物预测长度约150 bp。引物由苏州泓讯生物技术有限公司合成。
1.4 PCR检测
PCR反应体系为25 μL，包括宫颈脱落细胞DNA模板4 μL，PCR反应上下游引物为1 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共40个循环，最后72℃延伸10 min。5μL PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
2 结果
2.1 PCR产物检测结果
采用通用引物进行不同类型HPV检测后，其产物长度约150 bp。产物条带清晰易辨，无非特异性扩增，阴性对照无扩增产物（见图1）。
2.2 通用引物检测效果
6种HPV标本中，GP5/GP6通用引物可以检出HPV-16、18、11、6、52型，HPV-58、51、31和33型未能检出（见图1）。
3 讨论
HPV感染与宫颈癌等肿瘤关系密切，但目前缺乏HPV病毒的体外培养系统，HPV-DNA检测代替病原学诊断方法，成为HPV感染诊断的“金标准”。PCR法简单方便，成本低廉，是检测HPV感染的理想方法。但由于HPV型别众多，难以寻找到一段保守序列用于引物的设计，因此开发PCR通用引物是检测不同型别HPV的唯一方法。
本研究根据我国境内常见HPV型别，包括HPV-11、16、18、31、33、51、52和58型L1基因序列[3]，选取相对保守一段序列设计通用引物GP5和GP6。并且在PCR扩增时，采用较低的退火温度以降低PCR反应严谨性，允许引物和目的基因之间存在一定程度错配，以提高扩增成功率[4]。我们的检测结果表明，GP5和GP6通用引物可以检出HPV-16、18、11、6和52型，已基本涵盖我国境内高毒力型HPV，具有极高的临床应用价值[5]。
在后续研究中，如需要进行HPV型别鉴定时，可以将阳性PCR产物进行测序，通过BALST比对后即可知道HPV类型。该方法可以节省大量检测费用，操作简单，更适合于在临床推广使用。
参考文献
[1]Juan C，Feoli-Fonseca JC，Luc L.Human papillomavirus study of 691 pathological specimens from Quebec by PCR-direct sequencing approach [J].J Med Virol，2001，63（4）： 284-292.
[2]Takeshima E，Tomimori K，Kawakami H，etal.NF-κB activation by Helicobacter pylori requires Akt-mediated phosphorylation of p65 [J].BMC Microbiol，2009，9（1）： 36-44.
[3]Chansaeoj J，Theamboonlers A，Junyangdikul P，etal.Whole genome analysis of human papillomavirus type 16 multiple infection in cervical cancer patients[J]. Asian Pacific J Cancer Prev，2012，13（2）：599-606.
[4]Hildesheim A，Schiffman M，Bromley C，etal.Human papillomavirus type 16 variants and risk of cervical cancer[J].J Natl Cancer Inst， 2001， 93： 315-318.
[5]Cornet I，Gheit T，Franceschi S，etal.The IARC HPV variant study group：human papillomavirus type 16 genetic variants： phylogeny and classification based on E6 and LCR[J].J Virol，2013，86（12）：6855-6861.
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