川红花与新疆红花对大鼠软组织损伤的影响
时间：2023-02-16 18:35:07 来源：千叶帆 本文已影响人
唐军，李刚敏，孙晨，陈银，邵茂，姜治桦，陈瑶，谢晓芳，彭成
(西南特色中药资源国家重点实验室/成都中医药大学,四川 成都 611130)
红花，又名红蓝花、刺红花，为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，夏季花由黄变红采摘，阴干或晒干制成成品，功效为活血通经，散瘀止痛，用于经闭、痛经、恶露不行、疤痕痞块、胸痹心痛、瘀滞腹痛、胸胁刺痛、跌扑损伤、疮痈肿痛[1]。我国的药用红花曾以四川简阳“川红花”和河南“怀红花”最为出名，现在红花的主产区则主要是新疆、云南、甘肃一带，新疆现在是我国最大的红花产地，产量占据了全国产量的80%以上[2]。本文通过单味药评价药效的方式，比较原红花主产地(四川简阳)和当下红花主产地(新疆昌吉)所制红花酊对大鼠软组织损伤的治疗效果，评价两个产地红花的药效，从而为红花的道地性研究提供相应的理论依据。
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量(200±20)g，购于四川省中医药科学院实验动物中心，许可证号：SCXK(川)2018-19。
1.1.2 实验药品 收集四川简阳和新疆昌吉人工栽培的红花，经成都中医药大学中药种质资源库陈江副教授鉴定为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花。制备高、低剂量的红花酊：将简阳、昌吉红花分别称80 g、40 g用纱布包裹，用400 mL 60%乙醇浸泡于4个密闭容器中，红花全部淹没，静置一周后过滤，所得滤液即为对应简阳、昌吉产地的高、低剂量红花酊。云南白药酊(云南省昆明市呈贡新区云南白药集团股份有限公司，批号：ZMC1801)。
1.1.3 实验试剂 95%乙醇，0.9%生理盐水，2%戊巴比妥钠溶液，4%多聚甲醛(成都市科隆化学品有限公司，批号：2020112601)，TNF-α试剂盒(Elabscience，批号：E-EL-R2856c)，IL-10试剂盒(上海瑞番生物科技有限公司，批号：MM-0195R1)。
1.1.4 实验仪器 高速冷冻离心机(Beckman Coulter,型号：Allegra X-30R)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司，型号：DHG-9030A)中，高级多功能酶标仪(Thermo Scientific，型号：VARIOSKA)，血液流变仪(北京赛科希德科技股份有限公司，型号：SA-9000)。
2.1 造模方法
将49只大鼠按体重随机分为正常对照组、模型对照组、云南白药酊组、简阳红花高、低剂量组(JY 0.2 g/mL、JY 0.1 g/mL)、昌吉红花高、低剂量组(CJ 0.2 g/mL、CJ 0.1 g/mL)，每组7只。造模时，大鼠以50 mg/kg腹腔注射2%的戊巴比妥钠溶液麻醉后，将左边臀部及左下肢毛发用动物剃毛器清除，然后俯卧位固定，在左下肢大腿处垫上纱布，在该大腿上方垂直竖立一根45 cm长管道，将200 g砝码从管道上端口放入，使其自由落体砸在大鼠左大腿肌肉丰厚处，重复6次，观察造模部位出现瘀斑并明显肿胀即造模成功，若造模时有皮肤破损或出血，明显骨折等情况，则淘汰。
2.2 治疗方法
造模1 h后开始给药，蘸取药液涂抹患处，0.5mL/次，3次/d，连续4 d。简阳、昌吉红花高低剂量组给对应浓度的红花酊，云南白药组给云南白药酊，模型组给0.9%生理盐水。
2.3 指标检测
在末次给药24 h后，将大鼠麻醉，腹主动脉取血制备抗凝血，进行血流变学检测。另取未抗凝血2 mL，制备血清，在4℃，离心力746×g条件下离心15 min制备血清，ELISA法检测血清中的TNF-α和IL-10水平；
处死大鼠，在固定位置取大鼠损伤部位肌肉组织，肉眼观察后，将其浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，HE染色行病理组织学观察。
2.4 统计方法
3.1 对大鼠血液流变学的影响
与正常组相比，在6个不同的切变率下，模型组的全血粘度升高，红细胞聚集指数、卡松黏度升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
与模型组相比，昌吉红花高、低剂量组，云南白药组的全血黏度均降低，昌吉红花高剂量组、云南白药组红细胞聚集指数降低，昌吉红花低剂量组卡松黏度降低，差异有统计学意义(P<0.05)如表 1所示。
表1 大鼠血液流变学指标
3.2 对大鼠血清炎症因子的影响
与正常组相比，模型组大鼠血清TNF-α水平、IL-10水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)，表示造模成功，与模型组相比较，简阳红花高剂量、昌吉红花高剂量、昌吉红花低剂量、云南白药组TNF-α水平降低，昌吉红花作用最强；
云南白药组、简阳红花低剂量组、昌吉红花高剂量组IL-10水平降低，简阳红花低剂量组作用最强，差异有统计学意义(P<0.05)。且如表 2所示。
表2 大鼠血清炎症因子
3.3 对大鼠损伤软组织形态学的影响
造模后大鼠腿部肌肉细胞形态异常，肌间明显水肿增宽、大量炎症细胞(以巨噬细胞和淋巴细胞为主)浸润，有明显出血；
与模型组比较，各给药组组织未见明显出血，且炎性细胞浸润减轻，组织间隙的水肿有所减轻，呈现较好的量-效正相关。
软组织损伤是由各种急性或者慢性劳损以及自身疾病等原因导致的人体皮肤、皮下筋膜、肌肉、韧带、肌腱、关节囊及周围神经血管组织的病理损害。临床主要表现为局部组织的青紫、瘀斑、肿胀、疼痛[3]。软组织损伤在中医学属伤筋范畴，主要病机为血瘀气滞，脉络不和，治疗当以活血化瘀、消肿止痛为主[4]。急性软组织损伤处常因出血、局部组织缺血或缺氧导致无菌性炎症反应，激发炎症介质和促进炎症细胞因子的释放，引起血管壁通透性改变和血管收缩，组织液在组织间隙大量聚集，从而引起水肿、疼痛，毛细血管的破裂也会导致皮肤下出现青紫和瘀斑。
急性软组织损伤的治疗主要包括外治和内治，内治中西医主要口服非甾体类抗炎镇痛药，如阿司匹林、吲哚美辛肠溶片等，这类药物通过抑制环氧合酶的活性，干扰花生四烯酸的代谢，从而阻断前列腺素的生成[5-6]。这类药也做成外用制剂使用，如吲哚美辛巴布膏、吲哚美辛凝胶等。中医药治疗软组织损伤有独特优势，可采用中药、《黄帝内经》，发展至今有敷贴、薰洗、湿敷、搽擦等不同方法，酊剂、酒剂是常用制剂[7]。此方针灸推拿和联合疗法等。中药外治法最早见于《黄帝内经》，发展至今有敷贴、薰洗、湿敷、搽擦等不同方法，酊剂、酒剂是常用制剂[7]。此方法具有疗效显著、治疗方便、毒副作用小等优点，在日常的软组织损伤治疗中得到广泛应用。
图1 急性软组织损伤大鼠局部软组织形态学HE染色图(40×，Bar=200 μm)
TNF-α是促炎症因子，在中性粒细胞和内皮细胞的活化和趋化，黏附分子的表达等炎症反应中起重要作用[8]。可由激活的巨噬细胞、突触成纤维细胞、T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞等多种细胞产生[9]，能促进IL-1、IL-6等的产生，扩大炎症反应，诱发机体产生超氧化物，释放出溶酶体而损伤细胞，加重炎症反应[10]；
造模后血清TNF-α显著上升，给药后血清TNF-α水平出现明显下降，且昌吉红花酊对TNF-α的降低有更显著的疗效。
IL-10主要由激活的单核巨噬细胞、淋巴细胞、上皮细胞等产生，是机体内重要的抑炎症因子[11]。IL-10具有多项免疫调节功能，能抑制Th0、Th1、TH2等多种T细胞的分泌功能，减少使白细胞聚集的炎性因子和细胞黏附分子的产生，阻止炎症细胞的活化和聚集，还能抑制巨噬细胞和NK细胞活化功能，从而直接或间接抑制炎症反应[12]。本研究结果显示，模型组IL-10水平比空白组高，分析是机体应对急性软组织损伤时产生大量促炎症因子所产生的代偿反应[13]，通过增加IL-10的释放来减轻炎症反应；
给药组因给予红花酊剂后炎症减轻，从而代偿性升高的IL-10水平降低。
血液流变性是研究血液、血细胞、血浆的流动性和变形性以及这种特性对循环和全身功能代谢的影响。全血黏度是血液流变性的综合反映，全血黏度增高表示血液流变性质异常，组织血液灌流障碍[14]。软组织损伤后，炎性物质释放导致微循环障碍，毛细血管通透性增加，导致血流减慢，瘀阻，纤维蛋白原含量增高，血细胞电泳时间延长，血浆黏度和全血黏度增高[15]。本实验中，不同切变率下的全血黏度给药组均小于模型组，表示红花酊外用可降低急性炎症引起的血液黏度，从实验结果看昌吉红花比简阳红花作用更强；
HE病理检测结果表明，红花酊剂可减轻急性损伤部位软组织的炎症细胞浸润和细胞间隙水肿，以昌吉红花效果略好。
本实验显示，昌吉红花对软组织损伤的治疗作用较优。红花中化学成分主要包括黄酮类、生物碱类、聚炔类、木脂素类、有机酸类、烷基二醇类以及甾体类等化合物[16]，研究表明，红花活血化瘀功效的主要有效物质之一是羟基红花黄色素A(HSYA)，是药用红花中起效作用最强的水溶性成分[17]。董文彬等[18]采用大鼠心肌缺血及血瘀模型进行研究，发现羟基红花黄色素A能明显减少心肌缺血大鼠的心肌梗死面积，显著减少血清肌酸激酶MB型(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)的产生，抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集，降低心肌缺血大鼠的血液黏度，还可一定程度延长血浆凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)，显著降低大鼠血浆纤维蛋白原含量。HSYA可显著改善血液流变学指标，如全血粘度、血浆粘度、红细胞变形性和聚集性，但对红细胞压积无明显影响，其作用机制可能与其抑制血栓形成、抑制血小板聚集、调节前列环素/血栓素(PGI2/TXA2)及改变血液流变学有关[19]。宋玉龙等[20]通过对不同产地的红花质量分析研究发现，伊犁、塔城、昌吉地区红花的羟基红花黄色素A含量较大为1.55%～2.32%，新疆和田、四川、云南地区红花的羟基红花黄色素A含量较小为1.08%～1.68%。徐山[21]研究发现，新疆红花中羟基红花黄色素A含量均值规律为昌吉州(2.42%)>塔城地区(2.18%)>伊犁地区(1.92%)，提示这可能是昌吉红花酊剂对急性软组织损伤大鼠的血流变和炎症因子的改善作用优于四川红花的原因之一。
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