利用CRISPR/Cas9,技术定向编辑水稻OsIQD1,基因
时间：2023-02-18 09:00:09 来源：千叶帆 本文已影响人
林春姿，谢华斌，黄其伟，高 上，王加峰
（华南农业大学农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心，广东 广州 510642）
【研究意义】钙调素（Calmodulin,CaM）作为细胞内主要的Ca2+传感蛋白，通过与不同的钙调素结合蛋白（Calmodulin Binding Proteins,CaMBPs）结合传递钙信号，调控细胞生理和生长发育过程。IQD 家族蛋白属于一类CaMBPs，是Ca2+信号传导的重要感受器［1］，在各种陆地植物上都很常见［2］。已发现的IQD 家族蛋白的结构、生物学功能不尽相同，但大多在植物生长发育和调控生物胁迫与非生物胁迫过程中发挥重要作用，且它们的亚细胞定位模式各不相同［3］。AtIQD1 与KLCR1 和CaM 相互作用，从而将驱动蛋白与Ca2+第二信使信号联系起来［4-5］。其他IQD 家族蛋白也可能介导不同的驱动蛋白转运信号通路，例如蛋白质分选或细胞壁形成［6］。IQD家族最早在拟南芥和水稻中发现，已发现拟南芥、水稻、大豆、番茄、玉米中有33、29、67、34、26 个IQD基因［2,7］。目前绝大多数IQD1基因的具体功能尚不明确，利用CRISPR/Cas9 编辑技术对水稻IQD基因家族成员OsIQD1进行定点编辑，获得的突变体对探究OsIQD1基因调控水稻生长发育与逆境响应的作用机制等均具有重要意义。【前人研究进展】IQD 家族蛋白均含有IQ 基序（IQxxxRGxxxR），其功能的深入研究是阐明Ca2+/CaM 介导的胞内钙信号转导通路的关键［2,8］。拟南芥AtIQD1 定位于细胞核和微管，与CaM 以依赖于Ca2+的方式互作，并与多种蛋白质同时相互作用以整合Ca2+信号防御生物胁迫［9-10］，而AtIQD22表达受赤霉素抑制，被DELLA基因诱导，表明AtIQD22参与植物防御反应和生长发育的调节［11］。过表达番茄IQD12/SUN会导致番茄果实变长，茎和叶穗轴扭曲生长，推测与生长素的分布改变有关，可见IQD12/SUN参与调节植物的生长发育［12-13］，而ZmIQDs 和PtIQDs 对干旱胁迫起关键作用［14-15］。虽然IQD 家族蛋白很早就在水稻中被发现，但它们的具体生物学功能尚未见报道。基因编辑是利用核酸酶（Cas9）对基因组的目标基因进行剪切编辑，从而使目的基因发生突变而改变某一特定性状的技术。利用基因编辑技术准确有效地对水稻基因组进行修饰，对水稻重要性状的改良具有重要意义。CRISPR/Cas9 系统是继锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFN）技术和类转录激活样效应因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN）技术之后的新一代基因定点编辑技术，利用 CRISPR/Cas9 技术可对目标基因进行插入或者删除式的基因敲除［16-18］。CRISPR/Cas9 编辑系统作为植物遗传改良的有效途径，自2013 年以来在水稻、小麦、玉米、番茄、烟草、大豆等农作物中成功实现了对目标基因的定点编辑［19-23］。【本研究切入点】本研究团队前期通过酵母双杂筛选实验发现Pik-H4 和OsIQD1 存在互作关系，进一步解析水稻OsIQD1 的功能对揭示其在水稻生长发育、逆境胁迫调节过程中的作用机制具有重要意义。【拟解决的关键问题】以水稻OsIQD1为目的基因，通过CRISPR/Cas9 基因编辑与转基因技术相结合，获得水稻osiqd1突变体材料，以期为后续开展OsIQD1 参与的抗稻瘟病具体调控通路的功能解析奠定重要基础。
1.1 试验材料
供试的水稻材料为粳稻Pik-H4 NIL，是华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心利用诱变株系H4 与LTH 构建的含有抗稻瘟病基因Pik-H4的近等基因系。Cas9-gRNA 表达盒载体pGTR 和pRGEB32 购自Addgene 公司。编辑靶点引物、核酸测序服务分别由生工生物工程（上海）股份有限公司、北京擎科生物科技有限公司完成。BsaI 内切酶、T4 DNA 连接酶、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶分别购自NEB（北京）有限公司、南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
1.2 靶点设计
利用OsIQD1的CDS 序列在CRISPR/Cas9 在线靶点设计网站（http://skl.scau.edu.cn/ targetdesign/）设计2 个特异性靶点。对2 个靶点的编码区序列进行扫描分析，以原间隔子邻近序列（Protospacer Adjacent Motifs，PAM）前20 个碱基作为候选靶点，以日本晴全基因组为参考序列，选择特异性高的序列〔第1 外显子和第5 外显子（DUF4005 结构域）区域〕为靶位点，设计2 个20 bp 的编辑靶点，旨在提高无功能蛋白的发生概率从而实现目标基因敲除。为保证OsIQD1靶点序列的一致性，在Pik-H4 NIL 中对两个靶点区域序列分别进行PCR扩增、测序，以分析靶点序列是否与日本晴序列一致，所用引物如表1 所示。
表1 PCR 扩增靶点区域序列所用的引物Table 1 Primers used for PCR amplification of target region sequences
1.3 基因编辑载体构建
敲除载体构建参考Kabin 等［24］的方法。根据分别来自第1 外显子、第5 外显子的2 个靶点设计引物（表2）。以pGTR 载体为模板，分别用3 对引物（L5AD5-F 和OSIQD1-target1-R、OSIQD1-target1-F 和OSIQD1-target2-R、OSIQD1-target2-F 和L3AD5-R）扩增相应片段。各片段进行凝胶回收纯化后用BsaI 进行酶切，并用T7 连接酶组装3 个片段，然后将组装产物用引物（S5AD5-new-F 和S3AD5-new-R）再进行一轮PCR 扩增。PCR 反应体系：2 μL 模板DNA、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP、1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，S5AD5-new-F 和S3AD5-new-R 各2 μL，17 μL ddH2O。PCR 反应程序：95℃预变性5 min；
95℃变性15 s、57℃退火15 s、72℃延伸15 s，35 个循环；
72 ℃终延伸5 min。PCR 产物纯化后用FokI 进行酶切，最终得到gRNA-靶点1-tRNAgRNA-靶点2-tRNA 片段。将Cas9 蛋白表达载体pRGEB32 用BsaI 进行酶切，利用T4 连接酶将带有靶点的纯合片段与酶切载体进行连接重组，将重组载体转化大肠杆菌DH5α 后进行测序分析，阳性转化子转化农杆菌EHA105 感受态，并侵染转化Pik-H4 NIL 愈伤组织，经2 次筛选、分化、生根，将转基因幼苗进行种植。用CTAB 法提取T0代转基因植株叶片DNA，用抗潮霉素基因（HPT II）特异引物（HPT-F：5´-ATTTGTGTACGCCCGACAGT-3´ 和HPT-R：5´-GTGCTTGACATTGGGGAGTT-3´）进 行PCR检测以确定转基因阳性植株。
表2 基因编辑载体构建所用的引物Table 2 Primers used for gene editing vector construction
1.4 基因编辑株系的靶点分析
为检测OsIQD1基因靶点的突变情况，利用引物OsIQD1-target1-test-F、OsIQD1-target1-test-R、OsIQD1-target2-test-F、OsIQD1-target2-test-R（表1）分别对转基因阳性植株的OsIQD1基因2 个靶点区域的DNA 序列进行PCR 扩增。PCR 反应体系：1 μL 模板DNA、12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix，引物各1 μL，9.5 μL ddH2O。PCR 反应程序：95℃预变性5 min；
95℃变性15 s、57℃退火15 s、72℃延伸1 min，27 个循环；
72 ℃终延伸5 min。获得PCR 扩增产物分别为280、357 bp，将靶点区域位置的扩增片段进行测序，并与野生型区域序列进行比对分析，鉴定突变植株的基因变异类型。
1.5 OsIQD1 敲除植株的病程相关基因表达量分析
基于前期研究已知Pik-H4 与OsIQD1 存在互作关系，Pik-H4 又受稻瘟病菌诱导，因此进一步检测野生型和突变体中的病程相关（Pathogenesisrelated,PR）基因表达量。PR1a和PR1b是最早报道的水稻PR1基因家族成员［25-26］，其编码的蛋白质剩余类丝氨酸羧肽酶（Serine Carboxypeptidase-Like Proteins,SCPLs）［27］。剪取野生型和突变体植株的叶片，检测稻瘟病菌病程相关基因的表达量，引物序列如表3 所示。
表3 稻瘟病菌病程相关基因表达检测所用的引物Table 3 Primers used to detect the expression of genes related to the course of disease in Magnaporthe oryzae
2.1 水稻IQD1 同源蛋白分析
为获得水稻IQD1的候选蛋白，用AtIQD1 蛋白序列在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）数据库进行同源搜索，结果（图1）表明，水稻中存在3 个与AtIQD1 同源性较高的候选蛋白，分别为Os01g0833800（41.67%）、Os05g0123200（44.27%）和Os05g0463300（46.77%），Os01g0833800 基因包含7 个外显子，CDS 全长1 503 bp，编码501个氨基酸，蛋白质结构C 端有1 个DUF4005 结构域。Os05g0463300 基因包含5 个外显子，CDS全长1 617 bp，编码539 个氨基酸，蛋白质结构C 端含有1 个IQ 基序。Os05g0123200 含有6 个外显子，CDS 全长1 425 bp，编码475 个氨基酸，蛋白质结构的 N 端含有1 个IQ 基序，C 端含有1个DUF4005 结构域。已知IQ 基序（IQxxxRGxxxR）主要是少数几个CaM 与CaMBPs 结合的结构域之一［28］，而DUF4005 结构域是一种由59 个氨基酸组成的肽，在体外直接与微管结合［29］。已 知OsIQD1的TIGR Rice Genome Project ID 为Os05m00240［2］，且根据比对氨基酸序列结果推测，Os05g0123200 为AtIQD1的同源基因OsIQD1。
图1 OsIQD1 与AtIQD1 同源性分析Fig.1 Homology analysis of OsIQD1 and AtIQD1
2.2 pRGEB32-OsIQD1-gRNA 双元载体构建
为获得OsIQD1定点编辑突变体，在OsIQD1基因第1 外显子、第5 外显子各设计1个靶点，将组装好的纯合片段连接到pRGEB32载体骨架中，得到pRGEB32-OsIQD1-gRNA 双元载体（图2 A、B）。利用OsU3 启动子测序引物（pRGEB32-CX-F 和 pRGEB32-CX-R）对 构建载体上的靶点进行测序，结果如图2 C 所示，2 个靶点序列与所设计靶点序列一致。抽提相应的质粒DNA，利用NheⅠ和Hind Ⅲ进行酶切鉴定，获得大小约为5.57 kb 和10.69 kb 的目的片段（图2 D），表明OsIQD1的2 个靶点正确组装到 pRGEB32 载体上。本研究构建的载体适用于后续由农杆菌介导的水稻遗传转化中，为获得OsIQD1水稻突变体奠定基础。
图2 gRNA 靶位点、pRGEB32-OsIQD1-gRNA 表达载体组装示意图及阳性克隆鉴定结果Fig.2 gRNA target sites,assembly diagram of pRGEB32-OsIQD1-gRNA expression vector and positive clone identification results
2.3 转基因植株鉴定
利用农杆菌介导法将pRGEB32-OsIQD1-gRNA 表达载体转入水稻材料Pik-H4 NIL 愈伤组织中，获得30 株转基因植株。用筛选标记抗潮霉素基因HPT II特异引物（HPT-F 和HPT-R）对转基因植株进行PCR 鉴定，以载体质粒为模板作为阳性对照，野生型日本晴DNA 为模板作为阴性对照。结果（图3）表明，本研究成功获得30 株阳性转基因植株。
图3 转基因株系抗潮霉素基因HPT II 的PCR 鉴定Fig.3 Identification of hygromycin resistance gene HPT II of transgenic line by PCR
2.4 突变类型分析
为明确OsIQD1基因靶点是否发生定点编辑，进一步对经潮霉素检测鉴定为转基因阳性植株的突变位点进行分析。由于OsIQD1基因的2 个靶点在序列上相距2 587 bp，利用两对引物（表1）扩增各靶位点区域DNA 片段。以获得的转基因阳性植株基因组DNA 为模板，用相应的引物对靶位点序列进行PCR 扩增并测序。以野生型序列作为参考，分析比较OsIQD1转基因株系中各靶位点附近序列的测序峰图，并利用解码网站（http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/）对全部转基因植株进行测序分析。结果（表4）表明，30 个转基因阳性株系中，有10 个株系的OsIQD1基因发生了定点编辑现象，其中有6 个株系（m1、m2、m6、m8、m10 和m17）的两个靶点区域均发生了编辑；
有8 个株系（m1、m2、m3、m6、m8、m10、m17和m25）的靶点1 被编辑，共有13 个编辑事件，编辑效率为21.67%，如m1 中存在大片段缺失导致蛋白翻译提前终止，而m6 中一条染色体存在2 bp 缺失引起移码而导致翻译提前终止（图4A、B）；
有8 个株系（m1、m2、m6、m8、m10、m17、m21 和m22）的靶点2 被编辑，共有16 个编辑事件，编辑效率为26.67%，如m1 已经是纯合突变，两条染色体中均有1 bp 缺失导致翻译提前终止，而m6 中一条染色体也有1 bp 缺失引起移码导致翻译提前终止（图4C、D）。综上分析可推测，部分突变株系（如m1）在T0代时目的基因的功能就丧失，而杂合突变需要在T1、T2代继续测序比较分析。
图4 部分转基因株系中两个靶点的测序结果比对Fig.4 Sequencing comparison of two targets in some transgenic lines
表4 部分转基因植株中OsIQD1 基因靶位点编辑情况Table 4 Editing of OsIQD1 gene targets in some transgenic plants
本试验收获部分T0代株系的种子进行扩繁得到T1代植株，经检测发现3 种突变类型：（1）敲除靶点1 存在2 bp 缺失，敲除靶点2 存在1 bp缺失，并且测序峰图并未出现严重的双峰现象，表明osiqd1-1为纯合株系；
（2）敲除靶点1 存在一条链缺失1 bp、另一条链缺失两个大片段的现象，敲除靶点2 存在1 bp 插入、测序峰图靶点1有双峰现象，靶点2 并未出现严重的双峰现象，表明osiqd1-2尚未完全纯合，但仍可作为后续试验材料；
（3）敲除靶点1 存在1 bp 插入，敲除靶点2 存在1 bp 替换且1 bp 插入，并且测序峰图并未出现严重的双峰现象，表明osiqd1-3为纯合株系（图5A、B、C）。通过荧光定量PCR 检测osiqd1-1、osiqd1-2、osiqd1-3等3个独立株系的OsIQD1基因表达量，结果（图5D）显示，这些突变株系的基因表达量显著低于野生型的表达水平。本研究获得了具有稳定遗传的CRISPR/Cas9敲除OsIQD1的转基因植株。
图5 OsIQD1 的CRISPR/Cas9 敲除植株验证结果Fig.5 Verification of OsIQD1 knock-outed plants via CRISPR/Cas9
2.5 OsIQD1 敲除植株的病程相关基因表达量分析
病程相关基因一般作为免疫响应的标记基因。本研究检测了野生型和突变体中稻瘟病菌病程相关基因PR1a和PR1b的表达量，结果（图6）显示，野生型植株PR1a和PR1b基因表达量相较于osiqd1突变体均上调，说明OsIQD1参与植物的免疫反应过程。
图6 病程相关基因PR1a(A)、PR1b(B)在野生型WT 和osiqd1-1、osiqd1-2、osiqd1-3 植株中的相对表达水平Fig.6 Relative expression levels of disease-course related genes PR1a and PR1b in WT and osiqd1-1,osiqd1-2 and osiqd1-3 plants
2.6 OsIQD1 转基因T1 代植株的获得
经前期鉴定获得OsIQD1转基因3 种突变类型植株（图7），与野生型Pik-H4 NIL 相比，OsIQD1转基因T1代幼苗植株生长相对一致，但分蘖数增多。敲除OSIQD1后对水稻抗病的影响需要进一步检测。
图7 osiqd1-1、osiqd1-2、osiqd1-3 与野生型WT 幼苗植株形态特征比对Fig.7 Morphological characteristics of osiqd1-1,osiqd1-2 and osiqd1-3 compared to the WT
水稻作为全球主要的粮食作物之一，养育世界一半以上的人口。随着人口持续增长、耕地面积减少、极端环境频发等问题的出现，粮食产量和安全引起了国家重点关注［30］。解决当前粮食短缺的有效措施之一是在现有耕地的基础上，突破传统育种手段瓶颈，借助分子手段，实现精准、高效的分子设计育种，提高水稻产量［31］。但传统育种手段需要经过多代回交筛选，育种工作量巨大，周期较长，效率低下，且容易受连锁基因影响。而CRISPR/Cas9 是一种高效且简便的基因定点编辑技术，能快速获得目标性状改善并能稳定遗传的纯合突变植株，极大地缩短了育种周期［32-33］。
目前已经报道的水稻IQD基因有29 个，但只有OsIQD14得到进一步研究，而其他家族成员未得到深入研究。OsIQD14 在水稻籽壳细胞中高度表达，调节微管细胞骨架动力学以控制稻粒大小。除了定位到细胞核和细胞质外，OsIQD14还沿着微管分布。当OsIQD14 耗尽时，谷物变得更宽更短，作物产量增加；
当OsIQD14 过表达时，晶粒变得更长更窄，不会影响总产量［34］。本研究利用CRISPR/Cas9 技术，通过双靶点编辑方式，对水稻OsIQD1进行定点突变，相对于单靶点编辑得到较多单一碱基突变，极大提高了对OsIQD1的编辑效率。其中target1 位点的编辑效率为21.67%，target2 位点的编辑效率为26.67%，表明同一基因的不同靶位点会影响编辑效率，与已报道的细胞质分裂关键基因OsMAP65-3一致，载体的编辑效率与不同的靶序列相关性较大［35］。因此，为确保高效编辑，对目的基因编辑时应选用2 个以上的靶位点。
本研究T0代植株突变种类较为丰富，极大提高了OsIQD1变异的多样性，但鉴于CRISPR/Cas9 编辑植株的T0代转基因株系会产生纯合突变、杂合突变、双等位突变，以及未发生突变等4 种基因型植株，纯合突变株系比例相对较少，要获得较多的变异类型则需要对杂合突变、双等位突变等转基因植株后代的分离情况进行分析与鉴定。目前本研究利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对水稻钙调蛋白结合蛋白基因OsIQD1编码区序列进行定点编辑，获得了能够稳定遗传的种质材料，为后续开展水稻抗稻瘟病育种奠定了基础。
研究发现，过表达AtIQD1可以使拟南芥显著增强对坏死型真菌Botrytis cinerea的抗性，敲除AtIQD1则表现感病，下调一些与植物生物防御相关基因的表达［36］。水稻OsIQD1 是否具有与AtIQD1 类似的功能仍有待进一步研究。本研究通过创制水稻OsIQD1 突变体，旨在研究IQD1在参与水稻抗病具体调控通路中的作用机理。病程相关蛋白质是植物受病原物胁迫后诱导产生并积累的一类蛋白质，是植物防卫体系的重要组成部分，它们往往在植物抗病反应的下游发挥作用，在很多情况下是直接限制病原物生长的主要因素。最早报道的水稻PR1基因家族成员PR1a和PR1b，受稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、水杨酸（Salicylic Acid,SA）、茉莉酸（Jasmonic Acid,JA）等诱导，对光、伤害、磷酸酶抑制剂等胁迫和化学处理作出反应［25-26］。本研究结果表明，与野生型Pik-H4 NIL 相比，PR1a和PR1b在osiqd1突变体植株中的表达量明显升高，初步推测OsIQD1 参与植物的基础免疫反应过程。
鉴于CRISPR/Cas9 基因编辑可特异性敲除目标DNA 序列，本研究利用该技术，设计了分别靶向起始密码子（ATG）下游与DUF4005 结构域的两个靶点，对OsIQD1基因进行定点编辑，并获得了osiqd1纯合突变体材料。与野生型Pik-H4 NIL相比，osiqd1突变体在幼苗时期长势大致相同，但分蘖增多；
同时，PR1a和PR1b在osiqd1突变体中表达量明显升高，初步推测OsIQD1 参与到植物的基础免疫过程中，为水稻抗稻瘟病的研究提供了丰富的遗传材料，也为水稻的抗病育种奠定了重要基础。
