植物体细胞无性系的变异与检测

刘琦，王仁才，王然

(1.湖南农业大学园艺学院，湖南长沙 410128；
2.青岛农业大学园艺学院/青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室，山东青岛 266109)

植物组织培养是植物无性繁殖、基因工程育种、次生代谢物质工业化生产等研究与生产的基本技术手段。最早关于体细胞无性系变异的报道是在甘蔗离体繁殖过程中，发现其形态学、细胞遗传学和同工酶谱方面均有变异发生[1]。后来Larkin等[2]提出了体细胞无性系变异(somaclonal variation，SV)的概念，它是指在长期连续培养过程中，培养的细胞或植株会产生遗传物质变异或表观遗传水平上的变异，是植物组织培养过程中存在的普遍现象,不局限于特定的物种和器官，变异种类及所涉及的性状也相当广泛[3-4]。目前已经在150种园艺作物的约1 700个品种中有相关变异的报道[5]，如玫瑰[7]、蝴蝶兰[8]、花叶芋[9]等观赏植物，香蕉[10]、草莓[11]等经济作物以及红薯[12]、水稻[13]、小麦[14]等粮食作物。体细胞无性系变异一方面不利于保持无性系后代的遗传一致性，而另一方面这种高频率变异也为新品种选育提供了新来源[15]。

1.1 表型和生理特征的变异

体细胞无性系变异会使植株的表型特征发生明显变化，如叶形、叶色、花形、花色、株高、果形等方面会发生明显改变[16-18]。例如，通过愈伤组织再生的文心兰，变异株叶片呈现黄色条纹状[19]。在枣椰树的组织培养株系中，出现了白化叶片和扭曲变形的嫩梢[20]。经原生质体培养再生的菊花无性系花盘大小和花瓣颜色均出现了变异[21]。除表型变化外，在不断添加外源激素的培养基上进行培养的无性系体内激素含量或某些代谢产物含量也会发生变化。连续继代培养的马尾松组培苗，不同代数的内源激素含量差异明显[22]。在龙眼细胞培养过程中检测到黄酮类物质、芦丁和表儿茶素含量发生了变化[23]，说明变异株和正常株之间存在生理代谢方面的差异。

1.2 染色体变异

1.2.1 染色体数目变异

在植物组织培养过程中，细胞有丝分裂是外植体的脱分化、再分化及再生器官生长的基础。而在细胞快速进行有丝分裂过程中纺锤丝牵引姐妹染色单体到细胞两极时，有时会出现错误，使染色体未能正常分裂到两个子细胞，导致了后代子细胞的整倍或非整倍性的染色体数目变异[24]。对荔枝的愈伤组织、胚状体、组培苗根尖的染色体数目检测均发现了染色体数目变异的细胞[25]。在红核龙眼的愈伤组织培养过程中也检测到染色体数目异常的细胞，出现了多倍化细胞[26]。由大蒜愈伤组织再生的植株除二倍体外，出现了多倍体和超倍体[27]。在香蕉的胚性悬浮细胞培养的细胞染色体数目从6个到116个不等，为整倍体和非整倍体组成的混倍体[28]。咖啡的胚性悬浮细胞经过长期继代培养后，出现了染色体数目异常的非整倍体再生植株[29]。因此，经过细胞悬浮培养和愈伤组织的植株再生过程可能更易诱发染色体数目变异。

1.2.2 染色体结构变异

染色体结构变异指细胞在有丝分裂后期染色体两个着丝粒向两极移动形成染色体桥，染色体桥的随机断裂会导致染色体发生缺失、重复、易位和倒位等[30]。有研究报道经过愈伤组织再生的玉米植株出现了染色体断裂现象[31]。百合组织培养过程中存在一定的染色体结构变异，在继代培养8次后异型核种类和数量增加[32]。经组织培养获得的黑麦再生植株存在多种染色体结构变异，包括倒位、断裂、凝聚、双着丝点等[33]。已有的研究报道说明，组织培养的特定条件下，细胞的染色体结构变异较在自然条件下发生频率更高、更为多样。这可能是由于离体培养条件下，细胞在DNA复制和染色体分裂时对环境胁迫的缓冲能力变弱，从而导致染色体结构更易发生变异[27]。

1.3 DNA序列变异

DNA序列变异包括单碱基突变[34]，核苷酸的插入或缺失[35]等，这在植物的组织培养过程中也是常见的。如由玉米胚培养的再生植株中检测到有乙酰脱氢酶位点发生了变异，对该变异基因的序列分析发现，密码子GAG中的A转换为T，使肽链中原来的谷氨酸转变为缬氨酸[36]。利用现代的分子标记和全基因组测序技术使体细胞无性系发生的DNA序列变异更容易被发现。有研究对拟南芥再生的表型变异株进行全基因组测序发现，单碱基替换是最常见的核苷酸变化类别[37]。经过5个月悬浮细胞培养后再生的水稻，发生单核苷酸变异(single nucleotide polymorphism，SNP)频率为1.74×10-6[38]。

1.4 表观遗传学变异

在植物组织培养过程中，有些无性繁殖后代出现的变异性状是由于表观遗传变异引起的，这些变异有些是可以遗传的，也有些是不稳定的或可逆的，即回复突变。表观遗传学变异主要有DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA(miRNA)的调控[39]。

1.4.1 DNA甲基化状态的改变

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，DNA的某些区域结合一个甲基基团的表观遗传修饰过程。DNA甲基化可以通过与转录因子相互作用或通过改变染色质结构来影响基因的表达[40-41]，在细胞分化和抵抗外界胁迫等方面起着重要作用[42-44]。如长期培养的拟南芥悬浮细胞，其再生不定芽能力丧失，研究表明其DNA发生了超甲基化[45]。研究表明，在植物组织培养过程中，继代时间、生长调节剂的种类和浓度等因素均可能引起DNA甲基化水平的变化[46-47]。例如火龙果组培苗的DNA甲基化水平随继代次数的增加而升高[48]。经过组织培养后移栽的菠萝，出现条纹叶的变异株经检测甲基化水平升高[49]。离体繁殖的新西兰辐射松(PinusradiataD. Don)DNA甲基化水平升高，导致植株生长势和再生能力增强[50]。有研究发现，油棕无性系随着离体保存时间的延长，其DNA甲基化水平降低，产生“Mantled”变异，变异的油棕果雄蕊被类心皮结构取代，导致果皮含油量显著降低[51]。

1.4.2 组蛋白修饰

组蛋白是染色质的主要蛋白质组分，染色质的基本结构单位是核小体，每个核小体由146个碱基对的DNA链和H2A、H2B、H3、H4四种组蛋白的八聚体组成[52]。组蛋白修饰是组蛋白发生乙酰化、磷酸化、泛素化等修饰过程，是影响染色质结构的重要调控机制和基因表观遗传调控的关键[53-54]。新西兰辐射松的组蛋白H4和H3K4me3的乙酰化水平升高，导致针叶细胞的全能性增强[50]。组蛋白修饰在维持植物基因组稳定、调控基因表达、促进离体再生等方面发挥了重要作用。例如在拟南芥离体再生过程中，与分化相关的基因Wus(wuschel)的表达受到了组蛋白修饰的调控，使组织培养的组织保持细胞全能性[55]。在离体培养的烟草细胞有丝分裂过程也存在组蛋白修饰，如果在培养基中添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACIs)等化学物质可以抑制组蛋白脱乙酰酶，导致细胞周期的停滞，说明组蛋白修饰会导致有丝分裂过程发生变异[56]。

1.4.3 miRNA的调控

在植物不同类型的RNA中，miRNAs在转录和转录后水平上对基因沉默起着重要的作用，是植株生长发育和产生应激反应时调控基因表达的重要因子。同时miRNAs也能够调控细胞培养中的胚胎发生、分生组织形成和器官发生等过程，突变与miRNA生物合成相关的关键基因会导致胚胎发生和分生组织发育缺陷[57]。在离体再生过程中，生长素和特异性miRNAs是胚胎形成和体细胞结构发育的两个必要条件[58]。在不同的培养基成份、温度和环境条件下，对于难再生的物种可通过调控其miRNAs的表达实现离体再生。对拟南芥的研究表明，miRNAs能够对生长素的调控网络起作用，生长素响应因子(auxin response factor，ARF)与miRNA390之间存在反馈调节作用，控制植物器官形成[57]。

1.4.4 转座子的激活

转座子(transposable element，TE)又称跳跃基因，是一种能够自主复制和移位、对基因起到调控作用的DNA序列。在大多数植物基因组中，转座子占了很大的一部分，最早是在玉米中发现的[59]。一般当外界环境改变或植物生理状态发生改变时会发生转座子激活现象。在玉米的体细胞无性系中发现转座子激活，可导致染色体断裂[60]。大多数转座元件在愈伤组织形成期间是被激活的，长期的愈伤组织培养会导致基因组不稳定。长期继代保存(约30 a)的伏令夏橙愈伤在培养过程中转座子发生了转座激活现象，单套染色体转座子拷贝数随着愈伤倍性增加而增加，研究同时证明，低温保存也是引起转座子转座激活的因素之一[61]。在组织培养的水稻中发现转座子插入导致再生株系发生体细胞无性系变异[62]。转座子区域存在一定程度的DNA甲基化，单拷贝序列的甲基化模式改变，可能会引起体细胞无性系变异[63]。

细胞无性系变异的发生通常受外植体本身的基因型和组织培养的环境因素的影响。在植物组织培养过程中常用的消毒剂、高浓度的植物生长调节剂(主要是生长素和细胞分裂素)、代替碳源的蔗糖等培养基附加成分、人为设定的培养基渗透势、人工光源、密闭容器内的高湿环境和某些气体成分的过量累积等，均可在一定程度上看作是对植物体的一种胁迫。这种胁迫能够促使植株产生氧化应激反应，导致植物组织体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)，如超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢含量升高[64-65]。这些活性氧物质能够分解蛋白质及引起遗传物质等的改变，因此，刺激植物细胞产生氧化应激反应的培养条件都能导致变异的发生[66]。

2.1 外植体的影响

2.1.1 外植体的基因型

外植体的基因型是体细胞无性系变异的内在因素，不同基因型的外植体，其发生变异的类型和频率不同。在百合再生植株发生染色体数目变异时，淡黄花百合的变异类型为三倍体和四倍体，而山丹百合的变异类型只有三倍体[32]。用蝴蝶兰原球茎进行组织培养时，‘F607’‘P. Little Mary’等品种花瓣和花序出现了明显的变异，变异率最高可达47.9%，而‘Annie’‘Taisuco Hatarot’等品种则没有出现任何变异[67]。另外，植物培养材料的遗传稳定性还受到外植体是否已经存在细胞突变的影响，尽管这些变异不一定表现出任何可见的变异性状。这种外植体常是变与未变的细胞或组织以嵌合体的状态存在，离体培养只是为之前预先存在的变异表现提供了条件。例如在有刺嵌合体黑莓的离体再生植株中，出现了无刺或短刺的植株[68]。

2.1.2 外植体的类型及生理状态

外植体的类型不同，产生变异的频率也不同。对茎尖、腋芽和分生组织的培养要比叶、根等成熟器官的组织培养产生的变异少[69]。利用菠萝‘Mitsubishi’品系的顶芽、腋芽和果实分别诱导出愈伤组织，经长期的继代培养后诱导再生植株。其中以顶芽为外植体的再生植株变异率为7%，而以腋芽为外植体的变异率达34%[70]。细胞无性系变异的频率与外植体的生理状态密切相关，越衰老的部位产生变异的概率越大。以成熟胚、幼胚为外植体进行水稻组织培养时发现，成熟胚的变异率最高[71]。

不同的增殖培养方式，遗传稳定性不同，由高到低依次为茎尖或茎段(带腋芽)培养、不定芽再生、体细胞胚胎发生、愈伤组织器官发生、细胞和原生质体培养等。茎尖分生组织一般为半球形穹顶状结构、具有持续或周期性分裂能力的细胞群，所以以茎尖进行无性繁殖稳定性最高，很少发生变异[52]。而通过愈伤组织器官再生时，无序愈伤组织细胞团在外源生长调节剂的作用下进行快速细胞分裂，此时的DNA复制常导致基因组的不稳定，增加了体细胞无性系变异的几率。有研究发现，月季的离体叶片通过器官发生途径再生得到的植株，发生了明显的DNA甲基化水平变化[72]。利用黄瓜的叶片直接再生、愈伤组织器官再生及胚性愈伤悬浮液再生3种培养方式获得的再生株系，经全基因测序及数据分析后发现，胚性愈伤悬浮液再生株系单核苷酸变异和小片段的插入位点均远远多于另外两种途径再生的株系[73]。

2.2 培养基成分的影响

2.2.1 植物生长调节剂

植物生长调节剂(plant growth regulators，PGRs)作为培养基的重要添加成分，能够影响细胞周期，对组织或器官的分化具有重要调控作用。同时，植物生长调节剂可以直接诱导体细胞无性系变异，或通过增加增殖率和诱导不定芽间接诱导变异的发生[68]。在培养基中添加一种激素和混合多种激素对无性系的诱变率是不同的，多种激素的混合使用，细胞无性系变异发生的概率更高[74]。

常见的几种能够诱导体细胞无性系变异的生长素类如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)和细胞分裂素类6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)、合成苯基脲衍生物(phenyl urea derivative，PUD)等。生长素类生长调节剂在组织培养诱导外植体脱分化、愈伤组织培养、芽增殖与生长及根诱导等过程中是必不可少的，但同时也增加了变异频率。对非洲紫罗兰进行叶片再生时，添加0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的培养基能够使体细胞无性系变异频率显著增加[74]。研究发现，在组织培养过程中加入2,4-D对外植体的脱分化、胚性细胞的形成及愈伤组织的诱导等有重要促进作用[75]，同时添加2,4-D会影响内源生长素的极性运输，打破体细胞胚的稳定性，造成变异[76-78]。例如，添加2,4-D的培养基培养的猕猴桃胚性愈伤组织再生植株出现了异常表型[79]。表观遗传学方面发生的变化也一定程度上归因于2,4-D的使用，2,4-D会导致DNA甲基化的发生，明显提高变异频率[80-81]。在香蕉的愈伤组织培养实验中，添加生长素2,4-D导致甲基化水平升高，特别是胞嘧啶甲基化，导致了组织培养植株的变异[82]。

外源细胞分裂素的添加也诱导了体细胞无性系变异的发生，最常用的为6-BA和噻苯隆(thidiazuron，TDZ)。TDZ是一种人工合成的、高效的生长调节剂，在不定芽增殖、体细胞胚发育、离体再生和组培植株开花方面起关键作用[83]。TDZ能够诱导植物产生许多形态上的变化，如在杏[84]、白鹤芋[85]、香蕉[86]等植物上有研究报道，能够导致叶形态异常，嫩枝扁化和芽基膨大等变异。最新的研究表明TDZ用于中草药作物的组织培养时，能够影响次级代谢产物的产生[83,87-88]。

在油棕的体细胞无性系变异研究中发现，生长素和细胞分裂素的不同浓度配比也影响着变异的发生。油棕组织培养的培养基中生长素/细胞分裂素浓度配比相对较高时，油棕发生‘Mantled’变异的概率较低，细胞分裂素/生长素浓度配比较高时，‘Mantled’发生率显著升高[89]。

2.2.2 其他培养基添加剂

培养基中除添加碳源、无机盐、生长调节剂等植物生长必须的营养元素外，在实际生产上还会添加抗乙烯化合物硝酸银等其他添加剂，这些添加剂也能诱导细胞无性系变异的发生。在辣木的组织培养过程中添加硝酸银(AgNO3)以减轻组培植株玻璃化，但经随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和简单重复序列间扩增(inter-simple sequence repeat，ISSR)两种分子标记检测发现发生了体细胞无性系变异[90]。在白梨的培养基中添加FeSO4替代EDTA-Fe螯合剂产生了耐高铁的株系，对变异株系进行RAPD分子标记分析发现了特异性条带[93]。

2.3 组织培养条件的影响

2.3.1 培养时间和继代次数

通常情况下，增加继代次数和持续组织培养的时间(特别是悬浮细胞培养和愈伤组织培养)能够增加细胞无性系变异发生的频率[94-95]。在组织培养过程中，较高的芽增殖率和继代频率导致DNA复制时可能会出现错误，从而导致发生变异。香蕉持续继代培养的植株与短期培养的植株相比，发生变异的频率更高[96]。利用ISSR和SRAP分子标记技术，对不同培养时间的红花愈伤组织进行检测，随着继代次数的增加，测到的多态性条带增加，说明随着继代次数的增加体细胞无性系变异发生的频率增加[62]。火龙果第四次继代培养的苗出现了矮化和杆棱数量增多的突变体，植株变异频率高达24%[95]。同时也有研究表明，经过长时间培养的植物组织，器官发生能力和再生能力会发生改变[96]。长期培养的咖啡愈伤组织在培养最初的27个月内可以再生，但是在连续组织培养36个月后，再生能力丧失[97]。

2.3.2 光质和光照强度

在组培环境中通常使用人工光源来模拟植物在自然生长条件下的光照强度和光周期，体细胞无性系变异受到不同波长和不同强度光源的影响。有研究发现，离体培养植物的各种形态、解剖结构和生理属性，如叶片形态、芽的伸长、腋芽的形成、体细胞胚的诱导、生根能力和光合能力等，均受到LED的光谱特性的调控。蓝光LED处理龙眼胚性愈伤组织的研究发现，光源波长通过多个miRNA影响基因表达，造成类黄酮的积累[98]。在番茄的组织培养时发现与正常光照相比，红光LED光照下植物的生长发育发生了多种形态和生理参数的变化[99]。在木瓜体细胞胚胎发生过程中的LED光源促进了蛋白质的差异积累，影响体细胞胚的再生率[100]。

2.4 植物组织培养材料的人工诱变

诱变处理指的是对植株或者植物的细胞组织使用物理诱变或者化学诱变剂，使植株发生基因突变，再进行一定的抗性筛选以此选育出优良的突变体。为了提高植物变异的频率，创造更多的突变体，以利于抗性突变体或新品种的选育，常用人工诱变的方法对培养的材料进行诱变。

2.4.1 物理诱变

物理诱变是利用物理因子对培养材料进行的遗传变异的诱变，目前应用较多的是辐照诱变。辐照诱变是使用一定剂量的物理射线来照射植株或愈伤组织等，诱导其发生遗传性的变异，再经过人工定向筛选鉴定，获得所需突变体。例如用60Co射线处理沟叶结缕草的愈伤组织后经过一定的压力筛选，选育出具有抗草甘膦的结缕草突变体[101]。用不同强度的60Co射线辐照甘蔗的带芽茎段，半致死剂量25 Gy辐照的甘蔗分蘖数、高度、重量和可溶性固形物的含量显著增加[102]。

2.4.2 化学诱变

常用的化学诱变剂有秋水仙素、甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS)、加硝基胍(nitrosoguanidine，NTG)、叠氮化钠等。其中，由于秋水仙素能够抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，常常用于多倍体材料诱导。用15、30、60、120 mg/L浓度的秋水仙素处理苹果离体叶片，均获得了同源四倍体植株[103]。以质量分数0.005%的秋水仙素通过混培法处理猕猴桃叶片，诱导出四倍体植株[104]。此外，由于EMS高频、高效、范围广、点突变多及产生染色体畸形概率小的诱变效果，在黄瓜的育种上通常利用EMS诱变的方法创造新种质[105]。

在离体培养环境下发生变异的数量比在自然栽培的植物种群中更大，也更容易被发现，如果在组织培养过程中较早的检测出变异，可减少不良变异对生产造成的损失。目前对于体细胞无性系变异的检测与鉴定，主要通过形态学评估、生理生化指标检测、细胞遗传学、生物化学和分子生物学等多个方面进行鉴定。

3.1 形态学评估

形态学评估是对植株表型进行量化，如植物的株高、茎粗、叶面积、形状、果实质量、果形指标和果色有无异常，通过数据统计分析有无明显差异。对无性系进行形态学评估是检测细胞无性系变异最直观、最简便的方法。对再生植株的表型检测已用于很多植物上。如芭蕉属植物最常见的变异表型为植株的矮化[106]。经过长期培养的胚性愈伤再生的橄榄植株中也发现了明显与生长有关的表型变异，包括株高、冠层体积、叶面积和果实大小[52]。经叶片再生获得的樱桃无性系群体也表现了叶片形态以及果实大小、形状和颜色等形态学差异[107]。

但对多年生作物的表型可能需要很多年才能表现出来，要观察其开花结果的表型有无变化甚至需要更长的时间，所以通过形态学方法检测和评估果树这类多年生作物的变异是非常耗时的[108]。另外，植物的表型是基因型和外界环境共同作用的结果，有些遗传变异表型可能不明显，也有些表型明显的变异仅仅是因为环境的影响，而非遗传物质的变异。因此，形态学评估的方法检测细胞无性系变异也存在一定的局限性。

3.2 生理生化指标的检测

在组织培养的任何阶段都可以进行生理生化方面的指标检测，这也是检测体细胞无性系变异的常用手段。在研究培养时间对红花遗传变异的影响时，采用酶联免疫法测定内源激素含量，发现培养至4～6代时植株体内生长素(indole-3-acetic acid，IAA)含量较高，赤霉素(gibberellin，GA)含量较低[22]。基于代谢物来分析变异也是常用的。例如在香蕉无性繁殖过程中出现的矮化株，通过对变异株和正常植株的气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)代谢物谱进行分析的结果显示，有82种代谢物差异显著且鼠李糖只存在于矮生株中。其他一些叶绿素、类胡萝素和花青素等代谢产物，也可以作为体细胞无性系变异的检测指标[17]。生理生化检测的缺点是操作复杂、检测指标多，有些情况下检测的指标并不能准确的确定变异的存在。

3.3 细胞遗传学方面的鉴定

细胞遗传学方面的鉴定主要观察染色体结构和数目的变化，一般采用细胞显微技术(染色体压片法、去壁低渗火焰干燥法等)进行染色体计数，染色体有丝分裂和减数分裂行为、结构的观察。对细胞染色体倍性判断更为快捷、准确的方法是流式细胞术。流式细胞术(flow cytometry，FCM)是通过对整个细胞或原生质体的细胞核中DNA进行特异性的荧光染料染色，来进行DNA含量分析，是一种非常有用的评估植物材料倍性的方法。与传统的细胞学方法(如染色体计数)相比，使用流式细胞仪在拟南芥的愈伤组织中同时发现了二倍体和四倍体[109]，在木槿[110]、香菜[111]、紫丁花[112]等多种植物上有应用的报道。

3.4 分子标记技术的应用

分子标记技术利用特异性引物扩增基因组碱基序列，通过比对有无多态性条带直接反应DNA水平的遗传多样性。该技术能够在组织培养的任何阶段进行，如果能提早发现不良变异可以减少不必要的损失，很大程度上推动了对细胞无性系变异的研究，前期研究已经应用许多分子标记技术检测到变异植株与原始植株基因序列之间的差异。常用的分子标记技术有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、STRs等，可以使用一种分子标记技术，也可以结合多种分子标记技术来检测细胞无性系变异[93,113]。对离体繁殖的草莓进行遗传变异的研究中使用了RAPD分子标记技术[114]。在近些年的研究中使用ISSR和PAPD两种分子标记技术最为常见[115]。例如有利用ISSR分子标记技术对康乃馨再生植株的遗传稳定性进行评价，但未检测到变异[116]。Vos等[117]用ISSR，RAPD和MS-ISSR 3种分子标记技术进行了巨芒草无性系的遗传稳定性评估。

在表观遗传方面通常采用甲基化敏感性扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)技术评估无性系基因组的甲基化水平。MSAP实际上是对AFLP技术的一种改进，其中甲基化敏感的限制性核酸内切酶(同工酶HpaII和MspI)对甲基化胞嘧啶具有不同的敏感性，并产生可识别甲基化DNA位点[118]。MSAP技术被用于检测咖啡和油棕等作物的体细胞无性系变异[119-120]。

3.5 同工酶标记

同工酶标记是对基因编码区外显子翻译成的蛋白质进行分析检测，一直以来都是研究遗传多样性和变异的方法，体细胞无性系变异也可通过同工酶标记技术对克隆蛋白和酶多态性进行分析检测[121]。植物体内有抗氧化防御系统来对抗氧化压力，从而在胁迫环境下生存。同工酶标记通常测定的酶包括脱氢酶、过氧化物酶、多酚氧化酶等[122]。在大豆[123]、马铃薯[124]等作物上有用同工酶标记技术进行体细胞无性系变异检测的报道。

虽然同工酶法检测遗传变异实验操作简单易行，但是由于其结果易受个体发育和外界环境的影响，同工酶的种类较少(仅检测可溶性蛋白)，因此检测结果多用于辅助分析。

3.6 基因组测序

全基因组测序技术是对个体基因组序列进行测序，通过对参考基因组比对的差异信息进行分类和注释。近十年来，随着高通量测序技术快速发展，全基因组测序技术成为检测细胞无性系变异的新方法。对土豆原生质体再生的无性系进行全基因组测序分析发现，与茎段繁殖的植株相比，染色体的某些区域发生了较高频率的变异，从而导致植物表型发生变化[18]。对于无参考基因组的物种，可以用简化基因组测序技术(specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq)进行全基因组变异率的检测，例如对文心兰体细胞无性系的研究发现，SNP变异的频率为1.00×10-3[19]。在黄瓜的无性系变异研究中，利用全基因组测序的方法，发现离体培养的黄瓜发生变异频率最高的是非编码区的SNP位点，变异位点占所有多态性的1%～4%。对变异位点基因的功能分析表明，它们与物质运输、生物合成和蛋白的修饰过程有关[131]。

4.1 优良新品种选育

体细胞无性系变异在不同的作物中产生了多种类型的变异体，可以将其进一步整合到育种程序中，以获得重要农艺性状。草莓的繁殖多采用茎尖分生组织培养的方法，在这一过程中产生了果实畸形、糖度改变、产量降低、花期变化等多种变异，育种家们利用草莓的这种变异培育了很多新品种[125]。通过辐照诱变培育出香蕉的早熟品种‘Novaria’[126]。目前采用最多的是通过物理诱变或化学诱变后施加选择压力，以此筛选到抗性优良的新品种。通过诱导体细胞无性系变异获得了对红腐病、黑穗病具有抗性的甘蔗‘CoA7601’已被推广种植[127]。在非生物胁迫的抗性育种中，也已经利用细胞无性系变异选育出抗盐和抗除草剂的优良品系，例如，由细胞系再生出的无性系具有耐盐性，筛选出耐盐害小麦突变体[128]，通过对不同铁浓度胁迫下沟叶结缕草胚性愈伤组织再生植株生理指标的测定，筛选出耐高铁离子浓度的沟叶结缕草植株[129]。

体细胞无性系变异并不局限于任何特定的植物类别，在粮食作物[130]、蔬菜[131]、果树[132]和林业树种[133]以及观赏植物中都存在广泛的体细胞无性系变异。此外，通过体细胞无性系变异产生的新颖的叶和花，在观赏植物育种中也具有很高的应用价值。

4.2 育种应用的局限性

由于体细胞无性系变异发生的不定向性，发生的变异也常常会对园艺植物的快速繁殖和实际生产产生不利影响。通过组织培养的油棕植株普遍存在变异，油棕在发生“mantled”变异后雄蕊被裂心皮结构覆盖，导致雌花不能受精，严重影响油棕的产油量[134]，并且这种变异直至开花时才能被发现。某些物种的离体培养通常会出现多种不利于生产的变异，例如草莓的离体培养过程中常会发生叶片畸形、果形变小、幼苗玻璃化或生根异常等不良变异[135]。体细胞无性系变异的产生仅限于能够在组培中繁殖并具有再生能力的植物种类。体细胞无性系变异有时会降低植株的繁殖能力甚至失去再生能力。另外，木本植物的生命周期很长，体细胞无性系变异产生不良性状时会造成经济损失[136]，如果想要在大规模无性繁殖后获得表型和遗传性一致的苗木，就必须避免体细胞无性系变异的发生。

不同的影响因素导致了体细胞无性系变异的发生，因此可以通过对这些因素加以控制来减少变异的发生。其次是寻找简单易行的检测手段发现变异，特别是在分子水平上，从培养早期和不同的培养阶段联合多种方法进行变异检测和遗传物质分析，尽量减小或避免产生不良变异的影响。总之，随着人们对体细胞无性系变异研究的深入，对其影响因素和变异规律以及变异调控问题的探索，体细胞无性系变异将在植物新品种选育和品种改良方面有着巨大的应用前景。

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