植物miRNA编码小肽(miPEP)的研究进展

胡媛媛，邱丽娟，阎哲

(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所，吉林 长春 130102；
2.中国科学院大学，北京 100049；
3.中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程/农业部种质资源利用重点实验室，北京 100081)

生物的基因组中除了编码蛋白的基因外，还存在着大量产生非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)的区域。一般认为ncRNA不会被核糖体翻译生成肽，而是通过影响染色体结构，修饰染色质等方式调控下游基因表达[1]。miRNA是一类长度通常在19～24 nt的内源性小分子非编码RNA。真核生物中的miRNA会通过序列互补配对的方式结合，并抑制靶基因的表达[2]。miRNA作为调节因子，具有高度的保守性，在植物生长、繁殖、抗病和抗逆等生物活动中发挥着重要功能，是植物基因表达调控网络中的重要组成[3]。

MIRNA基因最初被认为不会编码蛋白，而只通过RNA的形式行使功能。但随着分子生物学和生物信息学研究的逐渐成熟，研究人员分别在拟南芥(Arabidopsisthaliana)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中发现一些MIRNA基因中存在短开放阅读框，其在转录miRNA的序列同时也能翻译生成具有生物功能的短肽，而这类来源于MIRNA的短肽被称为miPEP[4]。随着对miPEP相关研究的逐步深入，miPEP被证明普遍存在于真核生物中，并在植物中参与诸如开花时间、根发育和结瘤共生等多种生物过程的调控[5]。现有的研究表明植物中的miPEP具有一定的特异性，其通过促进对应pri-miRNA的表达进而影响植物生长发育和形态建成。目前miPEP的相关研究尚处于初步阶段，miPEP的具体形成过程和其行使的功能还存在诸多疑问亟待解答。本文通过对现今植物中miPEP的形成、功能和调控机理三个方面的进行总结，以期能为未来miPEP的相关研究提供参考。

1.1 miRNA的形成

miRNA的形成主要包括两个步骤：首先，MIRNA基因通过RNA聚合酶II被转录生成具有局部发夹结构的pri-miRNA；
之后，DCL1(Dicer-like 1)蛋白识别pri-miRNA发夹结构，将pri-miRNA初步加工成前体miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)，并最终进一步切割成19～24 nt的成熟单链miRNA[6]。成熟的miRNA通常与AGO等蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，miRNA通过RISC蛋白复合体识别并结合靶基因转录本，通过切割或抑制靶mRNA翻译，在转录后水平抑制靶基因的表达[7]。

1.2 miPEP的形成

MIRNA基因与传统编码蛋白的基因类似，其启动子区域也包含CpG岛、TATA盒等顺式作用元件，而且miRNA基因同传统编码蛋白的基因一样也会被RNA聚合酶II特异识别，从而产生具有5′端甲基鸟苷帽子结构和3′端带有poly A尾的RNA转录本[2]。之前的观点普遍认为，在miRNA加工形成过程中，pri-miRNA发夹区上游和下游的序列不具有功能，在生成miRNA的过程中被迅速降解。然而，近期研究证明一些pri-miRNA序列中包含可能编码短肽的sORF，这些sORF区段不会被DCL蛋白降解，而是以某种方式从细胞核运输到细胞质中，在细胞质中被核糖体识别并翻译成具有生物功能的miPEP(图1)[8]。近期研究人员通过3′RACE和RNA-seq等实验方法，对植物的pri-miRNA进行测序分析，研究结果显示大多pri-miRNA的5′端都含有潜在编码短肽的sORF序列[8]。所预测的miPEP平均长度为24个氨基酸，而这些短肽的平均等电点与植物中已知蛋白质的平均等电点类似[8]。针对MIRNA基因生成的转录本片段序列进行分析，发现一些MIRNA基因会通过可变剪切形成不同长度的转录本，这一结果说明包含发卡结构的长转录本可能富集在细胞核中被加工形成miRNA，而短转录本则可能以类似mRNA的方式被运送至细胞质中，进而被核糖体翻译形成miPEP短肽[8](图1)。

注：实线箭头代表已知途径；
虚线箭头代表未知途径。

miPEP的命名目前在学界尚未有确切的标准，已发表文章中有两种命名习惯。一种是根据其来源的MIRNA基因编号进行命名，如：在拟南芥中MIRNA165a所产生的miPEP，被命名为miPEP165a[4]；
另一种命名方法是根据miPEP的氨基酸长度命名，如：在人肿瘤细胞中发现pri-miRNA-34a会翻译生成长度为133个氨基酸的miPEP，因而该miPEP被命名为miPEP133[9]。

miPEP是近几年才被人们发现并关注的一类功能性小肽，迄今为止在植物中仅有少数的miPEP被深入研究鉴定功能。根据已报道的研究结果，miPEP参与了多个植物生长发育以及环境响应的调控，具有极其重要的功能(表1)。

表1 植物中已知miPEP 的相关信息

2.1 miPEP调节植物根系的发育

miPEP165a是最早被发现报导的miPEP之一。研究发现拟南芥pri-miR165a序列包含一段可能编码短肽的sORF，而且这段序列在十字花科植物中非常保守[4]。研究人员将GFP报告基因融合到短肽基因起始密码子后，在根内皮层可以检测到GFP信号，同时核糖体印记测序结果也验证了核糖体可以结合MIR165a基因的序列[4]。研究发现miPEP165a在根部可以促进miR165a的表达，促进拟南芥分生组织区细胞数量的增加和根的生长，人工合成的miPEP165a也具有同样促进miR165a表达的功能，而这一调控依赖于RNA聚合酶Ⅱ[4]。

利用生物信息学方法分析十字花科不同植物的pri-miR156序列，发现至少有11个十字花科物种中的pri-miR156可以编码一段保守的短肽[10]。通过对表达信息进行检测，发现pri-miR156不仅在序列上保守，其在不同组织、不同生长阶段的表达变化也十分保守[11]。利用合成的miPEP156处理白菜的幼苗可以显著促进幼苗根系的生长[11]，这与过表达MIR156基因的表型相一致[12]。说明miPEP156可能通过调控miR156的表达促进了根系的发育。

miR171b来自植物界保守的miRNA171家族。在蒺藜苜蓿中研究发现miPEP171b与miR171b共表达，免疫荧光定位显示miPEP171b与miR171b均在侧根起始区表达[4]。在蒺藜苜蓿根中，过表达miPEP171b或外源施加miPEP171b均可以显著促进miR171b的积累，同时降低侧根密度[4]。在葡萄(Vitisvinifera)中，过表达或外源施加葡萄的miPEP171d会显著减少主根和不定型根的生长长度，并增加不定型根的数量[13]。

2.2 miPEP对花发育的调控

miPEP除了可以影响地下根系的发育外，对茎叶进行miPEP外源喷施也能调控地上部分miRNA的表达从而影响花的发育。在拟南芥生长过程中，对茎尖分生组织外源施用miPEP165a可以显著促进植物的发育，具体表现为缩短植株平均开花时间，增加花序长度[5]。通过实验证明地下施加miPEP165a对开花表型没有显著影响，这说明miPEP165a并不能通过长距离运输对地上发育途径进行调控[5]。后续实验研究也证明外源施加带有标记的miPEP165a可以进入拟南芥根的外皮层和皮层细胞，但无法进入维管束区域从而被传送到地上组织[5]。

2.3 miPEP对体细胞胚胎发生的调控

研究人员从龙眼(Dimocarpuslongan)中鉴定到3个miR166的前体序列，并在龙眼的体细胞胚胎中成功克隆到相关基因。通过分析克隆到的序列，发现pri-miR166 S78、pri-miR166 S338和pri-miR166 S53分别存在可以编码29、53和13个氨基酸的miPEP的序列[14]。前期研究报道miR166通过抑制生长素合成参与体细胞胚胎发生的调控[15]。同样外源施加人工合成的短肽证明miPEP166可以显著促进pri-miR166的表达和成熟miR166积累，进而调控龙眼体细胞胚胎发生。通过2,4-D、ABA和乙烯处理植株证实：植物激素可以通过调节miR166和miPEP166的积累参与调控龙眼体细胞胚胎发生，说明miPEP在植物激素调控通路中的重要作用[14]。

2.4 miPEP调控代谢产物的合成

之前大部分已报道的miPEP多来自于在植物界中广泛存在的保守miRNA家族。miR858至今为止只在拟南芥、欧洲云杉(Piceaabies)、苹果(Malusdomestica)、桃(Prunuspersica)、甜瓜(Cucumismelo)等9种植物中被发掘(https://www.mirbase.org/)。miR858被报导调控植物纤维素和类黄酮的合成[16-17]。在拟南芥中，选取pre-miRNA858a上游1 000 bp，通过序列分析发现该区域共有3个可能编码sORF的区域。将3个sORF的启动子序列与GUS融合分析活性，结果显示只有最靠近pre-miRNA858a的sORF启动子具有活性[18]。通过体内过表达miPEP858a，外源施加miPEP858或敲除miPEP858a，证明miPEP858a可以促进miR858a的积累，从而抑制miR858a靶基因CHS和MYB12等的表达。对转基因材料进行成分分析，发现miPEP858a可以抑制类黄酮和花青苷等代谢物质，同时也促进木质素的合成，最终影响拟南芥维管束和束间纤维长度、茎秆强度和抽苔时间[18]。

2.5 miPEP参与共生的调控

植物通过与微生物的共生互作，从而利用微生物特性来获取植物生长发育所需要的营养物质。植物根系与土壤中的微生物存在多种共生形式，其中最为常见的是植物根系与丛枝菌根真菌的共生，以及豆科植物特异地与根瘤菌的结瘤共生。

在丛枝菌根共生关系中，植物为真菌提供有机物，真菌向植物提供包含磷元素在内的营养物质。该共生过程中，miRNA171通过抑制转录因子LOM1实现对植物-丛枝菌根真菌共生的调控[19-20]。分析表明：蒺藜苜蓿miR171家族不同成员MIR171基因中均包含编码miPEP的序列。外源施加miPEP171a、miPEP171c、miPEP171d、miPEP171e或miPEP171f均能显著抑制LOM1的表达并降低菌根的定殖[21]。然而，miR171b与其他miR171不同，其与靶基因存在序列错配，因此miR171b 并不抑制靶基因表达，而是保护LOM1转录本不被其它miR171家族成员结合并切割[21]。外源施加miPEP171b会促进LOM1的表达以及菌根真菌的定殖[21]。对百脉根、番茄和水稻分别利用其物种自身的miPEP171b同源短肽处理，在三种植物物种中miR171b的表达和菌根定殖率均显著增加[21]。

豆科植物可以特异地与土壤中的根瘤菌共生互作，从而形成共生组织—根瘤。在根瘤内，植物为根瘤菌提供其生命活动所需的能量物质，而根瘤菌则将空气中的氮气转化成植物可以吸收利用的氮素[22]。miRNA172c通过抑制靶基因NNC1的表达从而促进下游结瘤关键基因NSP1、NIN、ENOD40-1等的转录，最终促进大豆(Glycinemax)根瘤的形成[23]。研究表明pri-miR172c也会编码miPEP，外源施加miPEP172c会增加大豆中miRNA172c转录本的含量，进而促进NSP1、NIN、ENOD40-1等基因的转录而显著增加大豆的结瘤数目[24]。

研究报道大豆的miR171o和miR171q分别调控GmSCL-6和GmNSP2，从而影响下游结瘤基因NIN的表达[25]。虽然miPEP171调控豆科植物结瘤的相关研究还未有报道，但miPEP171a和miPEP171b已被证明能显著增加对应miR171的积累，因此，miPEP171具有同时参与调控菌根真菌共生和结瘤共生的潜在可能[4,21]。

虽然miPEP在植物的生长发育调控方面具有重要的作用，但人们对其作用的机理仍不甚明晰。研究发现荧光标记的miPEP165a能在2小时之内渗透到拟南芥根冠和分生组织；
24 h后，荧光存在于根的中柱外的大部分区域[5]。实验证明miPEP可以在不同细胞类型间进行局部的移动，但其移动也会受到一些特异细胞类型的限制，使miPEP165a无法移动到维管束组织[5]。然而，使用带有荧光基团的miPEP-156a对芜青(Brassicarapa)幼苗根部进行处理，结果却显示该短肽可以通过根系运输到地上部分，而且主要富集在叶脉周围，证明miPEP156可以通过维管束从地下运输到地上组织[11]。不同miPEP在细胞间移动的研究结果表明，miPEP的长距离运输方式不能一概而论，可能会受到植物物种差异、miPEP分子量大小或氨基酸疏水性差异等因素的严格限制和调控。

对拟南芥网格蛋白/微膜区突变体植株的根系外源施加miPEP165a，实验证明miPEP短肽进入植物除了涉及被动扩散外，网格蛋白和膜微区也会参与介导miPEP的移动调控，且地上组织与地下组织可能有相似的miPEP吸收和运输机制[5]。利用可以抑制膜微区依赖性内吞作用的化学物质处理植株，结果显示处理后的植株中miPEP165a功能受到抑制，表明miPEP调控植物发育涉及网格蛋白介导的内吞作用和膜微区依赖途径[5]。

在植物中，miPEP多通过调控其对应的miRNA的表达从而参与植物生长发育的调控。对RNA聚合酶II的突变体nrpb2-3植株外源施加miPEP，与对照组相比，miPEP165a处理nrpb2-3并不会增加miR165的表达，从而证明了miPEP对miRNA的调控依赖于RNA聚合酶II[4]。利用miPEP处理植物细胞证明miPEP可以通过主动运输进入并富集在细胞核中，推测miPEP进入细胞核后通过与MIRNA基因序列结合，调控MIRNA基因的转录[8]。用miPEP171处理可以促进pri-miR171的产生，但对pre-miR171没有影响，说明响应miPEP调控的序列位于pri-miRNA发夹区以外[8]。通过外源施加含荧光标记的miPEP858a 可以显著提高包含miR858a启动子的 Pro-miR858a:ATG1:GUS和Pro-miR858a:ORF1:GUS中的GUS信号，进一步表明miPEP通过结合MIRNA基因5′端序列来调节miRNA的表达活性[18]。

综上，不同miPEP在植物体内的长距离运输方式各有差异，外源施加的miPEP通过被动扩散和胞吞途径进入植物细胞后富集于细胞核。在细胞核内miPEP与对应MIRNA基因5′端序列结合，促进pri-miRNA生成进而增加细胞中成熟miRNA的含量。

从第一个miPEP被发现至今，不到10年的时间里越来越多的miPEP被挖掘并被证明在植物生长发育中具有重要功能[4]。虽然这一领域逐渐受到关注，然而人们对于miPEP的形成和作用机理的了解仍然匮乏。

pri-miRNA在细胞核转录后会被DICER蛋白及时加工切割，形成pre-miRNA片段以及21nt左右的小分子miRNA。然而，miPEP的转录本如何能避免被DICER蛋白识别切割，同时miPEP的转录本如何被识别、运输到细胞质中并被翻译成短肽，这一机制的仍然未知。近期的报道发现：部分pri-miRNA可能在转录的过程中通过可变剪切被加工成大小不同的转录片段[8]。这一现象是否在MIRNA基因中普遍存在，植物系统是否通过对不同转录本片段的序列和结构进行选择，从而决定pri-miRNA转录本的最终命运；
同时系统如何调控pri-miRNA转录本可变剪切产物的形成，而这一调控机制是否受到发育及不同环境信号的影响，这一系列问题仍有待更多相关研究的解答。

在植物中，虽然大多miPEP被报导通过正向调控其对应miRNA的积累来行使功能，但在动植物相关的miPEP研究中，也发现了其他miPEP调控的机理。研究发现：部分动物的miPEP，如miRNA-8、miPEP155、miPEP497和miPEP200a等并未通过调控miRNA的表达行使功能[28-30]。其中，miPEP-200通过调节前列腺癌细胞的上皮-间质转化来抑制前列腺癌细胞的迁移[29]，而miPEP155在人树突状细胞中通过结合并干扰分子伴侣和热休克蛋白HSC70的功能，从而影响抗原递呈并抑制自身反应性炎症[30]。由此可见人们对于miPEP调控的分子机理了解的仍然不足。由于植物miPEP的相关研究才刚刚起步，植物中被鉴定到的miPEP也还非常有限，但通过更多miPEP被挖掘和鉴定，植物中miPEP是否也具有多样的调控机制将有望被解答。

除了对miPEP的形成和作用机理知之甚少外，人们对于miPEP进化的研究仍然空白。已报导挖掘的大部分miPEP都来自于在植物界中比较保守的miRNA家族，但经过分析比对pri-miRNA的5′端sORF，人们发现pri-miRNA编码的miPEP在序列上并没有共同的特征[4]。同时研究也证明即使来自同一miRNA家族，不同植物的同源miPEP并不会相互调控目标miRNA[4]。在蒺藜苜蓿中过表达miPEP171b并没有影响到其它miRNA的表达，而外源施加其他植物的miPEP171也不会对蒺藜苜蓿自身miR171表达产生影响[21]，这些结果说明miPEP在识别、调控MIRNA基因活性上具有严格的特异性，而这一严格的分子机制仍然未知。

miPEP在植物中的发现，不仅扩展了人们对非编码RNA功能的进一步认知，同时miPEP也为农业生产应用提供了一个新的有力工具[31]。miPEP普遍较小，易于合成也易于被植物吸收，能够通过外源施加的方式进入植物体内调控特异基因的表达。因此，作为一种潜在的高效植物肥，近些年受到了高度关注。前期研究已证明，miPEP可以调控植物的发育、代谢以及与环境的互作。利用这一潜力，国外生物公司已取得了一系列相关的专利，并正在开发、优化miPEP在农业生产上的应用[32-34]。miPEP在农业生产上具有非常大的潜力和前景，通过外源施加miPEP短肽，不仅仅有助于提高作物的生长发育，与传统的化肥农药相比，miPEP具有更强的特异性，对环境造成的污染更小[35]。随着后续大量miPEP被挖掘研究，利用miPEP短肽改善作物的农艺性状，将有潜力成为在农业生产上实现减肥减药、降低面源污染，促进绿色农业可持续发展的有力手段。

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