基于AMPK信号通路探讨虫草素对过氧化氢致心肌细胞损伤的保护作用
时间：2023-02-27 19:00:06 来源：千叶帆 本文已影响人
孙泽帆，王海波，翟昌林
(浙江中医药大学第四临床医学院·浙江 杭州 310053)
心血管疾病是危害人类健康的主要疾病之一，据报道，由于不合理饮食、缺乏运动、吸烟饮酒等危险因素的广泛流行，心血管疾病的病死率及发病率在未来5年会依然呈增长趋势，占总死亡率的40%[1]。蛹虫草作为一种名贵药材，其性平味甘，入肺肾二经，具有“益肺肾、止血化痰”等功效，在中医学被广泛应用。除此之外，有报道称，蛹虫草具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老及增强免疫力等作用，我国基于其生物功效研制的白血病新药也已进入I期临床阶段[2]。虫草素作为蛹虫草的主要活性物质，具有更加广泛的药理活性，包括抗炎症、抗氧化和抑制细胞分化等心血管保护作用[3-6]。既往研究表明，心肌细胞损伤或凋亡是导致各类心血管疾病的共同病理基础[7]，双氧水作用于心肌细胞会产生大量的活性氧，是经典的致心肌细胞氧化损伤的模型构建方式[8]，但国内外鲜有报道虫草素在该过程中的作用。基于上述背景，本研究观察了虫草素对于双氧水致心肌细胞氧化损伤的保护作用并探讨与AMPK信号通路的相关性，现报道如下。
1.1 实验材料 虫草素：江苏Unisyn Biotech公司，货号：Y120220215A。H9C2心肌细胞：上海中乔新舟生物科技公司。低糖DMEM培养基：Hyclone公司；
胎牛血清：Gibco公司；
CCK8试剂盒：Elabscience公司；
ROS试剂盒：南京建成公司；
Western抗体：Affinity公司，AMPK(货号：AF6423)、p-AMPK(货号：AF3423)、β-actin(货号：AF7018)。H2O2：环凯微生物。ELX800酶标仪：BIOTEK公司；
LSR Fortessa流式细胞仪：美国BD；
TZD-CL-200S显影仪：厦门天中达生物科技；
CKX41显微镜：奥林巴斯。
1.2 虫草素溶液的配制 使用分析天平称取虫草素1.01 mg，加入200 μL DMSO溶液，完全溶解后加入9.8 mL完全培养基(90%低糖DMEM培养基+10%FBS)，使用0.22 μm孔径的过滤器过滤除菌，母液浓度为400 μmol/L，根据前期预实验结果，选择加入细胞中的终浓度为10 μmol/L。
1.3 细胞培养 H9C2心肌细胞培养于37 ℃、5%CO2培养箱中，使用低糖DMEM培养基添加10%的FBS，细胞生长至80%予以传代。
1.4 细胞分组及处理 H9C2心肌细胞传代铺板后分为3组，分别为：正常组(Control)：正常培养，正常同步换液处理；
氧化损伤组(ODG)：待实验细胞生长密度达到70%时，加入H2O2,浓度设定为600 μmol/L，持续作用12 h。虫草素组(Cordycepin)：在构建氧化损伤模型前，加入虫草素10 μmol/L，持续作用12 h。
1.5 观察指标
1.5.1 CCK8实验检测H9C2心肌细胞活力 (1)消化对数生长期的H9C2心肌细胞，铺96孔板，每孔铺6 000个细胞，培养24 h；
(2)3组细胞分别处理：其中正常组予以换液处理，ODG组构建氧化损伤模型，虫草素组使用虫草素10 μmol/L预处理12 h后构建氧化损伤模型；
(3)向每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃孵育1 h；
(4)使用酶标仪设定450 nm检测波长，测定各组吸光度值；
(5)计算细胞活力值，细胞活力值=(实验组OD值-空白孔OD值)/(Control组OD值-空白孔OD值)×100%。
1.5.2 流式细胞仪检测H9C2心肌细胞ROS表达 细胞接种于6孔板，不同组别细胞经过相应处理后，将DCFH-DA(10 μmol/L)加入到6孔板中，37 ℃孵育30 min，PBS清洗细胞3次，导入流式细胞仪进行细胞内ROS测定。
1.5.3 Western blot检测各组H9C2心肌细胞AMPK通路的蛋白表达 PBS润洗3组细胞，放置于冰上，加入RIPA裂解液提蛋白，BCA法测蛋白浓度，调整浓度一致后以2∶1的比例加入3×loading buffer,95 ℃变性5 min，制分离胶和浓缩胶，进行蛋白电泳、转膜，5%脱脂牛奶室温摇床上封闭2 h，4 ℃摇床上孵育一抗p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)，孵育时长12 h，PBS润洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，PBS润洗后ECL化学显影，QuantityOne软件计算各组条带灰度值。
1.6 统计学方法 应用SPSS24.0统计软件进行统计分析，计量资料经正态性检验符合正态分布，以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；
P<0.05认为差异具有统计学意义。
2.1 各组H9C2心肌细胞活性比较 CCK8检测结果可见：与Control组相比，ODG组与Cordycepin组细胞活力值均明显下降(均P<0.05)；
与ODG组相比，Cordycepin预处理后，细胞活力值明显提升(P<0.05)。见表1。
表1 各组H9C2心肌细胞活力值比较
2.2 各组H9C2心肌细胞内ROS表达的比较 流式细胞仪检测结果可见：与Control组相比，ODG组与Cordycepin组ROS表达量均明显上升(均P<0.05)；
与ODG组相比，Cordycepin预处理后，细胞内ROS表达量明显降低(P<0.05)。见图1。
注：与Control比较,*P<0.05；
与 ODG组比较,#P<0.05
2.3 各组细胞AMPK通路相关蛋白表达的比较 Western blot结果可见：相较于Control组，ODG组p-AMPK的表达未见明显变化，Cordycepin相较于ODG组，p-AMKP/AMPK的表达明显上调(P<0.05)。见图2。
注：与Control比较,*P<0.05；
与 ODG组比较,#P<0.05
虫草素又称为虫草菌素，是提取于蛹虫草中的活性有效成分，也可通过人工培育或生物技术获取[9]。虫草素分子式是C10H13N5O3,分子量为251.25，是一种核苷类似物-3’脱氧腺苷，虫草素在近半个世纪来一直在各个领域得到了深入的研究，如：药理药效、药物代谢、化学合成、生物合成、分离纯化、理化性质等方面[10-11]。多项国内外的研究均表明虫草素具有多种药理活性，可应用于治疗多种疾病，主要的药理学作用包括神经保护、抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗炎、抗菌等[12-14]。在心血管治疗方面：Wang等[15]研究发现：虫草素可激活AMPKα信号通路发挥抗心肌肥厚的保护作用；
Park等[16]研究显示虫草素在大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中发挥了保护作用，可能与Akt/GSK-3β/p70S6k通路的激活相关；
何佛容等[17]将虫草素应用于老年大鼠发现：虫草素有效提升了老年大鼠的心脏功能指标，对心脏的舒张及收缩功能均有改善，同时缓解了心肌细胞的病变及结构紊乱，其机制可能与促进了Nrf2/HO-1通路的表达相关。基于虫草素对于心血管系统的保护作用，本研究重点探讨了其对心肌细胞氧化损伤的保护作用及与ROS表达、AMPK信号通路的相关性。
ROS属于细胞内的信号分子，其在多种转录因子、离子通道、蛋白磷酸酶、蛋白激酶及蛋白受体的形成和变化过程中均发挥了重要的氧化修饰作用，参与了多条信号通路的转导[18]。细胞内的ROS一旦过表达会引起胞体的ATP生成不足、线粒体功能受损、蛋白过氧化、DNA损伤及脂质氧化损伤等，最终造成细胞的凋亡[19]。AMPK具有“节能开关”的属性，在心肌缺血再灌注损伤过程中具有保护作用，在凋亡、自噬、内质网应激、脂肪及葡萄糖代谢中均有调控作用[20]。
ROS与AMPK的表达存在双向调节作用，细胞内ATP的消耗会引起AMPK的激活，而AMPK的浓度依赖性磷酸化由中间信使ROS诱导[21]。AMPK由ROS激活后参与调控了下游相关通路并进行信息传递，在一定程度上也会形成负反馈调节，对ROS发挥抑制作用[22]。基于以上理论，本研究首先构建了氧化损伤的H9C2心肌细胞，在虫草素10 μmol/L预处理后，证实虫草素可有效提升氧化损伤H9C2心肌细胞的细胞活性，流式细胞仪检测发现虫草素可有效抑制H9C2心肌细胞的ROS表达，Western blot结果证实虫草素预处理能够有效地促进AMPK通路的激活。
综上，虫草素预处理可有效发挥对心肌细胞氧化损伤的保护作用，其机制可能与AMPK信号通路的激活相关。
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