太平洋牡蛎在对Pb2+富集和排出过程中的生理水平变化
时间：2023-04-22 13:25:03 来源：千叶帆 本文已影响人
刘 伟，鞠 青，刘星辰
(1.山东省青岛生态环境监测中心，山东 青岛 266000；
2.烟台大学机电汽车工程学院，山东 烟台 264005)
重金属是一类备受关注的全球性污染物。由于工业废水及固体废物的不合理处置，导致海水水体受到大量的重金属污染[1-3]。铅及其络合物还被列为环境内分泌干扰物(environmental endocrine disrupting chemicals,EDCs)，可通过干扰生物体内激素合成、分泌、运输、反应及代谢等过程，从而影响生物体内的各项生理反应[4-5]。同时铅还具有与钙、铁和锌等生物必需金属离子相似的生理活性，能够代替这些必需金属离子与蛋白质和分子结合，从而影响海洋双壳类生物的生理代谢[6]。重金属污染物尤其是Pb2+胁迫对贝类的影响主要集中在急性毒性、富集以及免疫因子影响等方面[7-9]，而关于Pb2+胁迫对贝类生理代谢影响的研究相对较少。耗氧率、滤水率、摄食率以及排氨率是反应贝类新陈代谢活动的基本指标，同时也能反映贝类的生理状况[10]。重金属污染物通过在生物化学及细胞水平上对贝类产生毒性效应，导致贝类新陈代谢水平降低，从而影响贝类的耗氧率、滤水率、摄食率以及排氨率等生理活动。
牡蛎作为一种重要的经济贝类，因其成体终身营固着生活，不可移动，容易受到海洋污染的影响，对重金属污染物具有极强的富集能力。且因其分布广泛，种群数量大，因此牡蛎作为海洋重金属污染的指示生物被广泛应用于研究中[11]。目前，关于重金属对贝类毒性效应的研究主要分为个体、细胞和分子三个水平，而且研究方向主要集中在细胞和分子水平上，贝类生长、繁殖及代谢速率等生理指标方面的研究较少。
本实验从太平洋牡蛎(Crassostreagigas)的生理代谢指标入手，研究了牡蛎受到Pb2+胁迫及胁迫后排出Pb2+的过程中，贝类的滤水率、摄食率以及排氨率等生理指标的变化，以期为牡蛎等养殖贝类的安全生产提供基础数据，为养殖环境的重金属污染风险评估及渔业水质监测提供参考依据。
1.1 实验材料及试剂
实验于中国海洋大学生态学实验室进行，采用烟台乳山湾附近海域牡蛎养殖场养殖的太平洋牡蛎进行研究。选取大小均匀、个体健壮的太平洋牡蛎作为实验材料，以确保实验对象的代表性及同一性。将牡蛎用毛刷洗刷干净并去除表面的附着物后，置于聚乙烯养殖箱内驯化3 d，养殖箱规格为0.8 m×0.5 m×0.8 m，驯化期间不投喂饵料，24 h连续充气增氧。
驯化完成后的太平洋牡蛎以50～60个/m3继续暂养，养殖用水取自青岛太平角附近海域，经过滤、曝气后备用。保持养殖用水的pH值为7.5左右，盐度29‰，培养光强 10 μmol·m-2·s-1，光周期为12 h∶12 h，培养温度为(20±1)℃，每24 h换水1/2～2/3，连续充气增氧。期间以金藻和青岛大扁藻作为饵料投喂太平洋牡蛎。持续暂养直至太平洋牡蛎正常生活且死亡率低于5%，暂养结束的太平洋牡蛎用于毒性实验。选择大小均匀，长度为(2.0±0.5)cm的太平洋牡蛎进行毒性实验，实验前1天停止投喂饵料。
胁迫实验采用的Pb(NO3)2重金属污染物，为国药集团试剂有限公司分析纯试剂，配置成质量浓度为20 mg/mL的Pb2+母液，使用时用海水稀释至所需浓度。
1.2 实验方法
1.2.1 太平洋牡蛎对Pb2+的富集和排出实验
参照急性毒性实验结果，选择Pb2+的暴露浓度为0.2 mg/L，以自然过滤海水为对照组(未检出Pb2+)，实验设3个平行组，实验时间为18 d。每组随机投放40只已驯化的太平洋牡蛎，实验用牡蛎养殖箱为35 cm×20 cm×11 cm，每个养殖箱加入曝气海水3 L。分别在第0、3、6、9、12、15天和18天取样，每次随机取5只，用于富集过程中生理活性的测定。实验期间每隔24 h更换含相应Pb2+浓度的海水1次，实验重复3次。
根据急性毒性和富集实验结果，按照富集实验方法以0.2 mg/L的Pb2+持续胁迫18 d。实验设3个平行组，每组随机投放40只已驯化的太平洋牡蛎。实验期间每隔24 h更换含相应Pb2+浓度的海水1次，实验重复3次。胁迫完成后，取出牡蛎以过滤海水充分冲洗，放入自然过滤海水中(未检出Pb2+)，分别在第0、3、6、9、12、15天和18天取样，每次随机取5只，用于排出过程中生理活性的测定。实验期间每隔24 h更换海水1次，实验重复3次。
1.2.2 太平洋牡蛎对Pb2+富集和排出过程中耗氧率和排氨率的测定
在200 mL具塞磨口玻璃锥形瓶中装满过滤海水并溢出。将富集和排出步骤取出的实验牡蛎转移到锥形瓶中，每个锥形瓶放置5只牡蛎，每个处理组设三个平行样。小心装上瓶塞，使瓶内不留有气泡，将锥形瓶放到恒温培养箱中培养2 h。同时设置对照瓶，只装过滤海水，没有实验牡蛎。培养完毕，虹吸法取出海水，测定实验前后的溶解氧浓度和氨氮浓度，溶解氧采用Winkler碘量法测定，排氨率采用次溴酸盐氧化法测定。牡蛎取出用于后续生理指标测定[12]。
耗氧率由以下公式求出：
R=1 000×[(C0-Ct)×V]×0.7/(n×t)
在医院感染防控当中护理管理的作用是非常重要的,能够有有效地预防与控制医院感染的发生。要加强医院护理管理工作,提高护理质量,积极采取有效的措施预防医院感染。
式中：R为单个牡蛎的耗氧率，mL/(ind·h)；
Ct为培养瓶中氧的浓度，mg/L；
C0为对照瓶中氧的浓度，mg/L；
V为培养瓶中海水的体积，mL；
n为每个锥形瓶中投放牡蛎的个数；
t为培养时间，h；
0.7为将氧的质量转化体积的系数 [22.4(L)÷32(g)=0.7]。
排氨率由以下公式求出：
A=1 000×[(Kt-K0)×V]×1.2/(n×t)
式中：A为单个牡蛎的排氨率，mL/(ind·h)；
Kt为培养瓶中氨氮的浓度，mg/L；
K0为对照瓶中氨氮的浓度，mg/L；
V为培养瓶中海水的体积，mL；
n为每个锥形瓶中投放牡蛎的个数；
t为培养时间，h；
1.2为将氨氮质量转化为体积的系数[22.4(L)÷18(g)=1.2]。
1.2.3 太平洋牡蛎对Pb2+富集和排出过程中滤水率和摄食率的测定
滤水率和摄食率采用饵料浓差法测定，通过对比摄食瓶和对照瓶中饵料浓度的差异来研究Pb2+胁迫对牡蛎摄食的影响。
实验时，在数个100 mL烧杯中各加入80 mL适宜浓度的饵料培养液，并测定饵料的初始浓度。每个烧杯放置5只牡蛎，每个处理组设三个平行样，同时设两个不加实验牡蛎的空白实验。将烧杯放于黑暗处培养24 h，24 h后测定各烧杯中的藻细胞数。牡蛎的滤水率和摄食率按Frost(1972)的公式计算：
F=V×N×(lnCt-lnCtf) /t
G=F×(Ctf-C0)/(lnCtf-lnC0)
式中:F为滤水率，mL/(ind·h)，指一定量水样中牡蛎个体或总个体数在单位时间内滤过的含有一定数量浮游植物的水样量；
G为摄食率,cells/h，即为每只牡蛎单位时间里过滤的饵料细胞数；
V为实验容器体积，mL；
N为每个实验瓶中牡蛎个体数，ind；
C0为起始饵料浓度，×104cells/mL；
Ct为对照瓶中的最终饵料浓度，×104cells/mL；
Ctf为实验瓶中最终饵料浓度，×104cells/mL；
t为摄食时间，h。
1.3 数据处理
富集和排出实验完成后，根据实验组与对照组的统计数据利用SPSS13.0统计软件，对每个实验组进行显著性t检验。
2.1 太平洋牡蛎对Pb2+富集和排出过程中耗氧率的变化
太平洋牡蛎在对Pb2+的富集和排出过程中耗氧率的变化如图1所示。当太平洋牡蛎暴露于0.2 mg/L Pb2+浓度溶液中，随着胁迫时间延长，牡蛎的耗氧率持续提高，直至第12天时，牡蛎的耗氧率达到最大值。胁迫实验的第12至18天，太平洋牡蛎的耗氧率持续保持在较高的状态，并且无显著变化。在Pb2+的排出实验过程中，0～3 d时，牡蛎的耗氧率显著降低，至第6天，耗氧率降低到最低值，实验第9至12天，牡蛎的耗氧率与第6天相比没有显著变化。
图1 Pb2+富集和排出过程中耗氧率的变化
2.2 太平洋牡蛎对Pb2+富集和排出过程中排氨率的变化
太平洋牡蛎在对Pb2+的富集和排出过程中排氨率的变化如图2所示，与耗氧率变化基本相似。当太平洋牡蛎暴露于浓度为0.2 mg/L 的Pb2+溶液中，随着牡蛎对Pb2+的富集时间延长，其排氨率逐渐升高。直至Pb2+暴露第12天时，排氨率达到最高值。胁迫实验的第12至18天，牡蛎的排氨率变化不显著。在牡蛎对Pb2+的排出实验过程中，随着排出时间的延长，排氨率显著降低。在排出实验的0～3 d，排氨率呈现出显著下降的趋势，第6天时排氨率降低至最低值，实验第9至12天，牡蛎的排氨率与第6天相比没有显著变化。
图2 Pb2+富集和排出过程中排氨率(×10-2)的变化
2.3 太平洋牡蛎对Pb2+富集和排出过程中滤水率的变化
从图3可以看出，当太平洋牡蛎受到浓度为0.2 mg/L 的Pb2+溶液胁迫时，在太平洋牡蛎对Pb2+的富集过程中，随着牡蛎对Pb2+的富集时间延长，牡蛎的滤水率显著升高。直至胁迫实验进行至第9天，滤水率达到最高值。富集实验的第12至18天，牡蛎的滤水率与第9天相比没有显著变化。在牡蛎对Pb2+的排出实验过程中，随着排出时间的延长，滤水率显著降低。在排出实验的0～3 d，滤水率呈现出显著下降的趋势，第6天时滤水率降低至最低值，实验第9至12天，牡蛎的滤水率与第6天相比没有显著变化。
图3 Pb2+富集和排出过程中滤水率的变化
2.4 太平洋牡蛎对Pb2+富集和排出过程中摄食率的变化
结果如图4所示，太平洋牡蛎在对Pb2+富集和排出过程中摄食率和滤水率的变化基本类似。当太平洋牡蛎暴露于浓度为0.2 mg/L Pb2+溶液中，随着富集时间的延长，摄食率迅速提高。至第9天时，摄食率达到最大值，之后变化不显著。在排出Pb2+过程中，随着排出时间的延长，摄食率的变化更加迅速和更加显著。在排出的第3天，摄食率便呈现出了显著性地下降，至第6天，降低到最低值，之后变化不明显。
图4 Pb2+富集和排出过程中摄食率(×104)的变化(cells·ind-1·h-1)
将太平洋牡蛎重新转移到无Pb2+的过滤海水中，太平洋牡蛎的生理活动又迅速恢复到正常水平，其摄食率、滤水率、耗氧率和排氨率显著降低至胁迫初始的数值，即在排出实验初期(0～6 d)，Pb2+对太平洋牡蛎的毒性效应能够被快速消除。陈海刚等[17]研究发现，近江牡蛎和翡翠贻贝能够很迅速地将体内的Pb排出，表明这两种生物能很快地根据其生活环境的重金属变化做出改变。还有研究表明，栉孔扇贝在受到短期Pb污染后，转入清洁海水后一段时间后，其体内的Pb含量显著降低，Pb的排出率能够达到92%[18]。
由上述结果可以看出，在0.2 mg/L Pb2+胁迫下，太平洋牡蛎通过提高其生理代谢，包括摄食率、滤水率、耗氧率和排氨率等，来降低Pb对其产生的毒性效应。将Pb2+诱导18 d的太平洋牡蛎放入洁净海水中，牡蛎的生理代谢指标在6 d左右就能够恢复到胁迫前的水平。
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