重金属铅胁迫对人参光合特征与皂苷含量的影响

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[收稿日期] 2014-01-02

[基金项目] 吉林省科技发展计划重大项目（20126046）；吉林省博士后科研项目（RB201321）

[通信作者] *李刚，教授，主要从事药用植物资源与质量安全研究，Tel：（0431）87063825，E-mail：ligang6@yeah.net

[作者简介] 梁尧，博士，主要从事农产品质量安全风险评估研究，E-mail：liangyaosmart@163.com

[摘要] 为阐明Pb胁迫对人参光合作用与次生代谢产物的影响，探讨药用植物对重金属胁迫的响应机制，采用筒栽试验方法，对不同浓度铅（Pb）处理（0，100，250，500，1 000 mg·kg-1）下人参的光合特征参数与皂苷含量进行了测定与分析。结果表明，低浓度Pb处理（≤250 mg·kg-1）时，人参叶片净光合速率和SPAD的变化并不显著，当Pb质量分数达到500 mg·kg-1时，叶片净光合速率和SPAD均显著下降（P<0.05），当Pb质量分数为1 000 mg·kg-1时，二者达到最低，降低幅度分别为57.8%，11.0%。从人参根部总皂苷含量来看，Pb胁迫浓度为100 mg·kg-1时，总皂苷含量的变化并不显著，而当Pb质量分数达到250 mg·kg-1时，总皂苷含量显著增加（P<0.05），并在Pb质量分数为1 000 mg·kg-1时，达到最高。在Pb质量分数为0～1 000 mg·kg-1时，Pb浓度与叶片净光合速率和SPAD均呈现极显著的负线性相关（P<0.01），而与人参总皂苷含量呈现出显著的正线性相关关系（P<0.05）。由此说明，人参叶片光合作用与根部次生代谢对Pb胁迫的响应规律是反向的，高浓度Pb胁迫将抑制人参叶片的光合能力，但能够促进人参根部的次生代谢过程。

[关键词] 铅；人参；净光合速率；SPAD；皂苷

近年来，工农业迅速发展所造成的土壤铅（Pb）污染问题已引起了各国科学家的广泛关注^[1]。Pb是植物和动物生存与代谢的非必须元素，植物生长在Pb污染的土壤中，过量的Pb进入植物体内将对植物的各种代谢途径产生强烈影响，降低其产量和质量，并通过食物链的富集作用对人类健康产生严重危害^[2]。

重金属Pb对植物代谢的影响是广泛的。首先，Pb将直接影响植物的光合作用，相关研究多集中于探讨Pb对玉米、小麦与蔬菜等农作物的影响，但研究结果并不一致，如Pb胁迫将造成玉米叶绿体含量下降与叶绿体结构损伤，从而抑制光合能力^[3]，也有研究发现低浓度Pb胁迫将有利于小麦和蔬菜光合速率的提高^[4-5]，目前关于Pb胁迫对药用植物光合作用影响的研究仍鲜见报道。在受到环境胁迫时，植物次生代谢将被诱导产生更多的代谢产物，从而提高植物生存和自身保护的能力^[6]，因而次生代谢产物在协调植物与环境关系方面具有重要作用，同时，它是许多药用植物药理作用发挥的主要成分^[7]，因此，研究Pb胁迫对药用植物次生代谢的影响具有十分重要的意义。

人参Panax ginseng C. A. Mey.属于五加科多年生宿根草本植物，被誉为“百药之王”，其药用功效与药理作用是举世公认的。皂苷是人参的主要次生代谢产物，也是其药理作用发挥的主要有效成分。与传统伐林栽参相比，农田栽参由于其对森林资源与生态环境的保护作用而被广泛应用^[8]，随着其种植面积的逐年增加，科学制定农田栽参土壤环境重金属元素的安全标准对人参产业的可持续发展具有重要的意义。因此，本研究利用人参筒栽试验模拟土壤Pb污染，通过测定和分析人参光合特征与次生代谢产物的变化来探讨人参对土壤Pb胁迫的响应规律，以期为加深理解重金属对人参的伤害机制与制定农田栽参土壤环境质量标准提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计 采用筒栽土培方式于2013年5月初进行。试验用土选择未经其他污染、改良后的阔叶林下土壤，待土壤自然风干后，过5 mm筛，备用。根据土壤环境质量标准，Pb添加量共设5个处理水平，分别为0，100，250，500，1 000 mg·kg-1（以纯Pb2+计），Pb采用PbCl2，各处理重复3次。试验用筒选择内径30 cm、高度45 cm的塑料筒，每筒装土约18 kg。将PbCl2用水溶解后，分别加入土壤中拌匀，静置半个月后使用，使土壤各组分的Pb达到平衡，期间定期补水使土壤含水量维持在田间最大持水量的50%左右。人参种植采用移栽方式进行，选择生长年限为3年、大小和重量一致的人参，每筒栽种人参3株。将种植好的人参筒置于遮阴棚内（PVC蓝色塑料薄膜覆盖黑色遮阴网，透光率为30%），埋入土中，筒上边缘与地面齐平，模拟人参栽培地区的温湿度和光照条件，定期等量补水，保持70%左右的田间持水量。

1.2 光合指标的测定 在人参绿果期（7月10日）选择晴朗天气上午9：00—10：00，用Li-6400光合系统测定仪测定人参叶片中部的光合作用特征指标，采用内置光源，设定光强为400 μE·m-2·s-1[9]。同时采用SPAD-502测定仪测定人参叶片的叶绿素含量，10片叶测定后取平均值记为1次重复。

1.3 人参皂苷含量的测定 在人参枯萎前（9月20日），将人参根部取出，经清洗晾干后在40 ℃烘干至恒重，粉碎过100目筛，精确称取样品0.500 0 g，用中性滤纸包好，置索式提取器中，加入甲醇浸泡过夜，次日再加入适量甲醇在85 ℃左右微沸回流提取，控制滴速100～120滴/min，虹吸次数为5～6次/h，回流提取3次，每次2 h，以人参皂苷提尽为准（定性鉴别为阴性）。合并甲醇提取液，回收甲醇，将提取液置蒸发皿中，水浴蒸干，加甲醇溶解后，转移至10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置过夜，取上清液过0.22 μm滤膜即得供试样品。人参皂苷含量采用超高效液相色谱法（UPLC）测定，单体皂苷标准品购置于中国食品药品检定研究院，人参单体皂苷对照品超高效液相色谱图见图1。色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm），柱温35 ℃， 流速0.5 mL·min-1，PDA检测器，检测波长203 nm，进样量2 μL，流动相为乙腈和水，梯度洗脱（0～3 min，19%乙腈；3～4 min，19%～21%乙腈；4～5 min，21%～26%乙腈； 5～9 min，26%～27%乙腈；9～12 min，27%～32%乙腈；12～15 min，32% ～43%乙腈；15～19 min，43%～60%乙腈；19～20 min，60%～80%乙腈；20～21 min，80%～90%乙腈；21～23 min，90%乙腈），方法学考察结果显示精密度、重复性和稳定性良好。

1.4 统计分析 文中数据统计分析与图形绘制分别采用SPSS 17.0和ORIGIN 8.5软件进行。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Pb胁迫下人参净光合特征的变化 人参叶片的净光合特征与Pb浓度密切相关，见表1。不同浓度Pb胁迫下人参叶片净光合速率（Pn）分布在3.50～8.28 μmol·m-2·s-1，与无Pb添加处理相比，Pb质量分数为100，250 mg·kg-1处理下Pn的降低幅度并不显著，当Pb质量分数为500，1 000 mg·kg-1处理时，Pn显著降低，下降幅度分别为45.8%，57.8%，但二者之间的差异并不显著。经回归分析可知，随着Pb浓度的增加，人参叶片净光合速率呈逐渐降低的趋势，二者呈现极显著的负线性相关（P<0.01，y=-0.005x+8.003）。从气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）的变化来看，Pb质量分数为100，250，500 mg·kg-1处理对Gs，Tr的影响并不显著，但Pb质量分数为1 000 mg·kg-1处理显著降低了叶片的Gs，Tr（P<0.05），降低幅度分别为43.3%，38.4%。

从胞间CO2浓度（Ci）来看，Pb质量分数为100 mg·kg-1处理对Ci的影响并不显著，Pb质量分数为250，500，1 000 mg·kg-1处理显著增加了叶片的Ci，增加幅度分别为73.7%，129.5%，144.5%。经回归分析可知，人参叶片Ci与Pb浓度之间呈现极显著的正线性相关（P<0.01，y=0.160x+116.6）。由此说明，人参叶片的净光合速率和胞间CO2浓度对Pb胁迫的响应较为敏感。

2.2 不同浓度Pb胁迫下人参叶片SPAD的变化 Pb胁迫下人参叶片SPAD的变化见图2。人参叶片SPAD的变化范围在33.7～37.8。与无Pb处理相比，Pb质量分数为100，250 mg·kg-1处理下，叶片SPAD的变化并不显著，而Pb为500，1 000 mg·kg-1处理显著降低了叶片的SPAD（P<0.05），降低幅度分别为5.2%，11.0%，同时，二者之间的差异也达到了显著水平（P<0.05）。这与陶玲等^[10]关于Pb胁迫下豆类作物叶绿素含量的变化结果相一致。经回归分析，人参叶片SPAD与Pb浓度之间呈极显著负线性相关（P<0.01，y=-0.005x+37.802）。

2.3 不同浓度Pb胁迫下人参皂苷含量的变化 不同浓度Pb胁迫下人参皂苷总量及其单体含量的差异显著，见表2。人参总皂苷在36.3～46.8 mg·kg-1。其中皂苷单体Rb1在总皂苷中所占的比例最高，占皂苷总量的24.6%～28.7%，其次为皂苷单体Rg1，Re，Rc，Rb2，这4种单体相对含量的平均值较为接近，分别占皂苷总量的13.0%，14.6%，15.6%，13.0%，皂苷单体Rd，Rf，Rb3的相对含量相对较低，分别占皂苷总量的10.4%，5.2%，2.0%。

Pb对人参各单体皂苷含量的影响并不一致。与无Pb处理相比，Pb处理下单体皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Rd的含量均略有增加，且以Pb质量分数为500，1 000 mg·kg-1处理下增加幅度较为显著；单体皂苷Rf，Rb2，Rb3含量在Pb处理下保持不变或略有增 加，不同浓度Pb处理对它们的影响并未表现出规律性。经回归分析，仅人参单体皂苷Rd与Pb浓度之间呈现显著的正线性相关（P<0.05，y=0.001x+4.062），其他单体皂苷与Pb浓度并未表现出显著的相关性。从人参总皂苷的含量来看，表现为随着Pb浓度的增加，人参皂苷总量呈逐渐增加的趋势，其中Pb为100 mg·kg-1处理对人参总皂苷含量的影响并不显著，而Pb为250，500，1 000 mg·kg-1处理均显著增加了人参皂苷的总量，增加幅度分别为26.0%，28.6%，28.8%，但三者之间的差异并未达到显著水平。经回归分析可知，Pb浓度与人参总皂苷含量之间呈现显著的正线性相关（P<0.05，y=0.008x+40.32）。

3 讨论与结论

净光合速率是光合系统功能的直接体现，也是植株光合系统能否正常工作的主要指标^[11]。研究指出Pb胁迫将影响植物的净光合速率^[12]，但不同植物对Pb胁迫的响应规律有所不同，一些植物的净光合速率随着Pb浓度的增加逐渐降低，而有些植物对Pb胁迫的响应确表现为低浓度促进，高浓度抑制作用，这与不同植物所具有的生理特性和抗逆性密切相关^[13]。本研究中，Pb胁迫浓度小于250 mg·kg-1对人参叶片净光合速率的影响并不显著，而当Pb胁迫浓度达到500 mg·kg-1时，叶片净光合速率显著降低，且在胁迫浓度为1 000 mg·kg-1时达到最低，叶片净光合速率与Pb添加浓度之间呈现出极显著的负线性相关。植物净光合速率下降的主要原因可能在于一方面叶片气孔数量、孔径和开放程度受到抑制，另一方面由于叶片酶活力与光合组分等非气孔因素的受到影响^[14]。Pb对叶片酶活力的抑制主要表现在其能与蛋白质的巯基结合而影响光合羧化反应酶的活性，进而导致净光合速率的显著下降^[15]。气孔导度和胞间CO2浓度是评价气孔限制作用的重要指标，只有当气孔导度与胞间CO2浓度以相同的方向变化时，才能确定光合的下降是气孔限制造成的^[16]。本研究Pb胁迫下人参净光合速率的降低是什么原因引起的呢？低浓度Pb胁迫下人参叶片气孔导度的变化并不明显，而只有当Pb胁迫浓度达到1 000 mg·kg-1时，人参叶片气孔导度显著降低。从人参叶片胞间CO2浓度的变化来看，Pb胁迫后人参叶片的胞间CO2浓度值并未降低，反而呈现上升的变化趋势，并在Pb为1 000 mg·kg-1时达到最高，由此可见，Pb对人参叶片光合能力的抑制作用并非气孔限制引起的。

植物叶片的SPAD能够较很好地表达其叶绿素含量的变化规律，叶绿素含量的高低可以直接反映人参叶片功能活性的强弱^[17]。随着Pb浓度的增加，小麦叶片SPAD呈现先上升后下降的变化趋势，当Pb为100 mg·L-1时，SPAD最高，而当Pb为300 mg·L-1时，SPAD降到最低^[5]，这可能是由于低浓度Pb激发植物新陈代谢的活化作用，而高浓度Pb将降低叶绿素酶的活性并破坏叶绿素的微结构而造成的^[18]。本研究中，Pb小于250 mg·kg-1对叶片SPAD的影响并不显著，当Pb达到500 mg·kg-1时，随着Pb浓度的增加，SPAD逐渐降低。可见，低浓度Pb胁迫对人参叶片叶绿素的破坏作用并不明显，而高浓度的Pb将严重抑制其叶绿素的合成。这与人参叶片净光合速率的变化趋势一致，进一步证明了Pb胁迫对人参叶片净光合速率的影响是由于叶绿素含量下降而引起的。因此，未来应深入研究人参叶片叶绿素组成与相关酶类对Pb胁迫的响应特征，进而更好地阐述重金属对人参的伤害机制。

三萜人参皂苷是人参的重要次生代谢产物，当生长环境的光照、温度、水分和营养等条件发生变化或者受到外来侵害时，人参和西洋参等植物会调节体内的皂苷含量来应答这些环境胁迫^[19-20]。关于单一重金属胁迫对夏枯草熊果酸影响的研究指出，Pb，Cd添加增加了熊果酸的含量，且随着Pb，Cd添加量的升高，熊果酸的含量逐渐增加^[21]。本研究中，在Pb为100 mg·kg-1时，人参根总皂苷含量的变化并不显著，而当Pb达到250 mg·kg-1后，随着Pb浓度增加，人参根部总皂苷含量呈逐渐增加的趋势。可见，以 Pb为250 mg·kg-1为阈值，低于这一数值时，人参根部总皂苷含量的变化不显著，而高于这一数值时，人参根部总皂苷含量显著增加，这与Pb胁迫下人参叶片光合特征的变化规律完全相反。最佳防御假说从植物生理学的角度很好的解释了Pb胁迫对人参次生代谢的促进作用，即植物在胁迫环境下生长缓慢，植物受损的补偿能力较差，而产生次生代谢产物的成本相对较低，次生代谢产物的防御收益增加，因此，植物在环境胁迫下将产生较多的次生代谢产物^[22]。从人参单体皂苷对Pb胁迫的响应来看，仅单体皂苷Rd对Pb胁迫有着敏感的响应，其他各单体皂苷与Pb胁迫的相关性并不明显。研究指出，人参单体皂苷Re含量受基因控制，Rb1与环境密切相关，Rg1受两者共同调控^[23-24]，但这一结果受到人参样品的生长年限和分析测定条件的强烈影响。本研究中关于皂苷单体Rd对Pb胁迫的响应关系仍需进行更系统的研究后才能解释其原因，这也将为人们深入探讨人参皂苷对环境胁迫的应答机制提供理论依据。

[致谢] 中国农业科学院特产研究所王英平研究员在人参皂苷提取与测定方面提供的帮助。

[参考文献]

[1] Hürkamp K， Raab T， Vlkel J. Lead pollution of floodplain soils in a historic mining area-age， distribution and binding forms [J]. Water Air Soil Poll， 2009， 201： 331.

[2] Feleafel M N， Mirdad Z M. Hazard and effects of pollution by lead on vegetable crops[J]. J Agr Environ Ethic， 2013， 26（3）： 547.

[3] Ahmad M S A， Ashraf M， Tabassam Q， et al. Lead（Pb）-induced regulation of growth， photosynthesis， and mineral nutrition in maize （Zea mays L.） plants at early growth stages[J]. Biol Trace Elem Res， 2011， 144： 1229.

[4] Singh R P， Agrawal M. Effects of sewage sludge amendment on heavy metal accumulation and consequent responses of Beta vulgaris plant [J]. Chemosphere， 2007， 67（11）： 2229.

[5] 韩红江， 田琴， 李维平. 铅对小麦幼苗光合特性及抗氧化酶活性的影响[J]. 石河子大学学报：自然科学版， 2012， 30（1）： 18.

[6] Kiferle C， Maggini R， Pardossi A. Influence of nitrogen nutrition on growth and accumulation of rosmarinic acid in sweet basil （Ocimum basilicum L.） grown in hydroponic culture[J]. Aust J Crop Sci， 2013， 7（3）： 321.

[7] 黄璐琦， 郭兰萍. 环境胁迫下次生代谢产物的积累及道地药材的形成[J]. 中国中药杂志， 2007， 32（4）： 277.

[8] 梁尧， 李刚， 曹庆军，等. 人参产地土壤重金属污染现状及其修复技术的研究进展[J]. 中药材， 2013， 36（10）： 1709.

[9] 徐克章， 张美善， 武志海， 等. 人参不同生育期叶片光合作用变化的研究[J]. 作物学报， 2006， 32（10）： 1519.

[10] 陶玲， 郭永春， 李萍. 铅胁迫对3种豆类作物生理特性的影响[J]. 中国农学通报， 2012， 28（33）： 78.

[11] Tang L， Ying R R， Jiang D， et al. Impaired leaf CO2 diffusion mediates Cd-induced inhibition of photosynthesis in the Zn/Cd hyperaccumulator Picris divaricata[J]. Plant Physiol Bioch， 2013， 73： 70.

[12] Burzyski M， Klobbus G. Change of photosynthetic parameters in cucumber leaves under Cu， Cd， Pb stress [J]. Photosynthetica， 2004， 42（4）：505.

[13] 李亚藏， 梁彦兰， 王庆成. 铅对山梨和山荆子光合作用和叶绿素荧光特性的影响 [J]. 西北农林学院学报， 2012， 27（5）：21.

[14] 邵怡若， 许建新， 薛立， 等. 低温胁迫时间对 4 种幼苗生理生化及光合特性的影响[J]. 生态学报， 2013， 33（14）： 4237.

[15] 姚广， 高辉远， 王未未， 等. 铅胁迫对玉米幼苗叶片光系统功能及光合作用的影响[J]. 生态学报， 2009， 29（3）： 1162.

[16] 李林玉， 黄群策， 张书艮， 等. 低能氮离子束与 UV-B增强对水稻光合及蒸腾速率的影响[J]. 农业工程学报， 2013， 29（15）： 136.

[17] Liang Q H， Huang W H， Jarvis P. Use of a SPAD meter to measure leaf chlorophyll concentration in Arabidopsis thaliana[J]. Photosynth Res， 2011， 107： 209.

[18] Kaznina N M， Laidinen G F， Titov A F， et al. Effect of lead on the photosynthetic apparatus of annual grasses[J]. Biol Bull， 2005， 32（2）：147.

[19] 贾光林， 黄林芳， 索风梅， 等. 人参药材中人参皂苷与生态因子的相关性及人参生态区划[J]. 植物生态学报， 2012， 36 （4）： 302.

[20] 高明， 孙海， 张丽娜， 等. 铁、锰胁迫对人参叶片某些生理特征的影响[J]. 吉林农业大学学报， 2012， 34（2）： 130.

[21] 武征， 郭巧生， 王庆亚， 等. 夏枯草内在品质及生长特性对铅、铜、镉胁迫的响应[J]. 中国中药杂志， 2010， 35（3）： 263.

[22] Barto E K， Cipollini D.Testing the optimal defense theory and the growth-differentiation balance hypothesis in Arabidopsis thaliana[J]. Oecologia， 2005， 146（2）：169.

[23] Lim W， Mudge W K， Lee J W. Effect of water stress on ginsenoside production and growth of American ginseng （Panax quinquefolium）[J]. J Agric Food Chem， 2005， 53： 8498.

[24] Lee M J， Choi J S， Cha S W， et al. Variation in the ginsenoside profiles of cultivated ginseng （Panax ginseng C. A. Meyer） landraces in Korea[J]. Process Biochem， 2011，46：258.

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